EvolvR 突变过程示意图

细履平沙

a, The EvolvR system consists of a CRISPR-guided nickase that nicks the target locus and a fused DNA polymerase that performs error-prone nick translation. b, High-throughput sequencing shows that fusing nCas9 to PolI3M resulted in substitutions across an approximately 17-nucleotide window 3′ from the nick. Expressing nCas9–PolI3M with an off-target guide did not show substitutions at a frequency above our detection threshold (dotted line, see Methods ‘High-throughput sequencing data analysis’), whereas an unfused nCas9 and PolI3M yielded only one substitution and at low-frequency. c, Distribution of the substituted nucleotides; all four nucleotides were substituted by nCas9–PolI3M. d, Schematic of the fluctuation analysis workflow used to sensitively quantify targeted and global mutation rates. e, The global and targeted mutation rates of wild-type (WT) E. coli, nCas9–PolI3M, unfused nCas9 and PolI3M, PolI3M alone, and nCas9 alone were determined by fluctuation analysis. For all figures, ‘on target’ mutation rates were determined by expressing a gRNA that nicks 11 nucleotides 5′ of the nonsense mutation unless labelled otherwise, whereas the ‘off target’ mutation rates were determined by expressing a gRNA targeting dbpA, a fitness-neutral RNA helicase gene in the E. coli genome. Data are the mean of ten biologically independent samples and the error bars indicate 95% confidence intervals. Mutation rates throughout are mutations per nucleotide per generation.

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EvolvR 系统巧妙地将CRISPR/Cas9 的特异性与易错DNA 聚合酶的突变能力结合。它通过用户定义的20 nt 间隔序列的向导RNA (gRNA)来实现精准定位。EvolvR 有两个重要元件，包括变体Cas9 (nickase Cas9 或nCas9)[38]，其中RuvC核酸酶结构域发生了突变，仅发生单链断裂。还有一个直接与nCas9 融合的易错聚合酶(PolI3M)。PolI3M 包含3 个点突变，这些突变会增加其错误率并消除其校对活性。研究证明了这两种元件的融合使PolI3M 的诱变活性指向
nCas9 靶向基因组位点，而不是基因组中任何切口DNA。从机制上讲，nCas9 首先定位目标基因组位点，并gRNA互补的单链DNA 上产生一个切口。nCas9 分离后 ，PolI3M 在该切口处结合 。PolI3M 聚合一条新的DNA 链，偶尔引入错误碱基，并置换旧的DNA链 。在解离前，PolI3M 的瓣状内切核酸酶结构域切割原来的置换链，留下了一个可连接的缺口 。PolI3M 解离后，在宿主细胞内完成缺口的修复工作  。在任何可被CRISPR/Cas9 靶向的基因组或质粒位点下游的小区域引入半随机突变，EvolvR 可以重新定位并连续进化相同的位点。在第一次迭代中，EvolvR 在目标位点的突变率是野生型大肠杆菌的24 500 倍。为了进一步提高靶向突变率，将3 个点突变 (K848AK1003A，
R1060A)引入到nCas9 (增强的nCas9，enCas9)中以提高其解离率，增加了PolI3M 与DNA 结合的机会，从而提高了目标位点的突变率。此外，考虑到PolI3M 的持续合成能力 (15–20 nt) 是一个限制因素，将PolI3M 与T7 噬菌体的硫氧还蛋白结合域 (Thioredoxin-bingding domain，TBD)融合，用于提高PolI 的持续合成能力。基于这些改进，研究人员利用EvolvR 测试到的突变率是野生型的212 000 倍，且合成长度达56 nt。EvolvR 有很大的发展空间，拓展PAM 范围是其能被更广泛应用的一个关键， 可借鉴扩大CRISPR 靶向范围的研究。Hu 等[42]利用一种噬菌体辅助的连续进化系统 (Phage-assisted continuous evolution，PACE) 进化出一种能够识别多种PAM序列的SpCas9 变体 (xCas9)。xCas9 可以广泛识别多种PAM 序列 (包括NG、GAA 和GAT)，这支持了它在人类细胞中的应用，包括靶向转录激活，核酸酶介导的基因破坏以及胞苷和腺嘌呤碱基编辑。xCas9 具有更广泛的PAM 兼容性，但与SpCas9 相比，它具有更大的DNA 特异性。在NGG目标位点，它的脱靶全基因组活性较低，当使用非NGG PAM 作为靶标时，其脱靶活性较低。这一发现扩大了CRISPR 系统DNA 的靶向范围，并证明在Cas9 的编辑效率，PAM 兼容性和DNA 特异性之间没有必要的联系。Anders 等开发了一种SpCas9 突变体 (SpCas9-NG)，用于识别NG 而不是NGG。先前的研究表明，SpCas9 的Arg1333和Arg1335 分别识别NGG-PAM 中第二和第三个碱基。通过消除Arg1335 和第三个G 之间的碱基特异性相互作用来减少PAM 约束。新引入的非碱基特异性相互作用弥补了与第三个G 的碱基特异
性相互作用的损失，从而能够识别NG PAM。研究者发现SpCas9-NG 在NG PAM 靶点诱导插入缺失。此外，SpCas9-NG 与活化诱导的胞苷脱氨酶(Activation- induced cytidine deaminase，AID) 的融合可以介导NG PAM 在靶位点产生C-T 的转换。EvolvR 系统已成为CRISPR 工具箱中的一种最新的独创性工具。EvolvR 可以在任何细菌菌株中使用，但目前只测试了其在大肠杆菌中的用途，可能需要进一步优化其在致病性或肠道共生细菌中的用途。最后，EvolvR 能否应用于真核细胞尚待证实，其复杂的基因组结构和DNA 复制/修复途径可能需要进一步的工程优化