求助大肠杆菌高密度培养问题
我们在做大肠杆菌的工程菌株发酵。以下是基本信息：菌株为B21(DE3)；
携带质粒为PTRC99Z质粒（有外源基因）；
发酵罐：5L
培养基：多种培养基都试过。包括无机盐、复合培养基（配方见《高细胞密度发酵技术》 李寅 等 著，化学工业出版社）。碳源用过葡萄糖以及甘油，现象相似。
发酵液pH:6.8，以氨水调控；
发酵罐温度：25~30都用过，用以调节发酵初期细菌比生长速率；
发酵罐罐压：0.06、0.04MPa以及0.02MPa都试过；
转速：从400~900rpm都试过；
通气量：200L/h到400L/h都试过；
通过补料速率，控制溶氧为30%；
现象：
不管培养基、发酵工艺是什么样，每次菌长到0D600=30，就开始增长速度极慢（期间没有加任何诱导剂哦）；尽管发酵液离心后沉淀量一直增加，但是OD600的吸光值变化不大，甚至有所降低；
发酵液粘度增加，泡沫较大；
碳源一直在消耗，但是生物量不增加，产酸量大（因为消耗氨水量大）；
离心后，菌泥呈两种颜色，下层为乳白色（颜色稍稍淡黄，健康大肠杆菌颜色），上层颜色较深。
遂请问各位达人，上述现象原因为何？如何解决这些问题？不通入高浓度氧时候，OD最高能到多少（请生产PHB和PHA的朋友忽略这个问题）？ 用的什么有机和无机氮源？另外，有一个关键的问题你可能忽略了，发酵液中残糖维持在多少？乙酸浓度过高会抑制菌体生长。 用的有机氮源:
1.酵母抽提物
2.蛋白胨
3.蛋白胨+酵母抽提物;
无机氮源：
1、磷酸二氢铵；
2、硫酸铵。
至于碳源浓度,都是培养基的初始碳源消耗完以后才开始流加，甘油做碳源的时候我没有测过培养基的碳源浓度，但是葡萄糖做碳源时候，斐林试剂滴定法测碳源浓度发现葡萄糖浓度较低，我的溶氧是由碳源流加速度控制的，溶氧浓度在30~60％。
乙酸的确抑制大肠杆菌生长，但是乙酸合成原因是什么?我一直怀疑是种子或溶氧的问题，造成乙酸的合成，进而抑制大肠杆菌生长，因为1）我们的甘油种子是保存在-20℃;2）很多文献包括论坛上都说要通入高浓度氧，而我从来没有用过。
楼上大侠觉得是哪方面的问题? 建议看一下关于 类人胶原蛋白的文章
他们用的是重组大肠杆菌
部分现象还是一样的 有可能是培养基的问题，导致培养时产乙酸过高，5L的罐子长到一百五六是不成问题的
回 4楼(地平线) 的帖子
你是说不通入高浓度氧的时候么？还是通入高浓度氧？回 3楼(guolei) 的帖子
他们用的氮源是复合氮源，而且浓度极高，流加液里面的有机氮源也是浓度极高。这样的话成本不划算，而且溶氧的指导意义就不大了
回 2楼(hanjun80) 的帖子
乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环有关。在低速生长条件下通过氧化代谢作用产生的能量足以满足合成和异化作用的需求，不会产生乙
酸，而在高比生长速率时，大肠杆菌仅依靠氧化代谢不能提供足够的能量，必
须通过乙酸生成途径储备 ATP 和 NADH2。
----可见限制比生长速率能减少乙酸的生成，因此尝试增加碳氮比，即降低氮源含量；另外，限制葡萄糖比消耗速率，残糖维持在0-0.1%。菌体不长的情况我们也遇到过，但只是停止生长几个小时，随后就正常了，很可能也是乙酸抑制的原因。
回 7楼(gx0406) 的帖子
我们是通过控制发酵温度和糖流加速率调控比生长速率的，一般在0.2左右。至于氨氮，我们维持200~700mg/L。一般来说，氨水用于调控发酵液pH，以下两个情况会造成氨水流加：1）培养基中的氮源消耗，产生酸根。理论上，这不会造成培养基pH的增加；2）发酵产酸，这会造成培养基氨氮浓度增加。
因此，请问楼上，根据你的经验，这么低比生长速率，残糖和氨氮浓度不高，为何产酸量大?
回 8楼(hanjun80) 的帖子
这都是相对来说的，控制低的比生长速率，防止乙酸的过量生成，在这种情况下能实现高密度培养，表现为整体的产酸量较大；而在过高的比生长速率下反而达不到这样的目的。你试试把残糖维持再低点0-0.1%，你们用的什么控制器，可以把发酵罐设置成联动--残糖几乎为0时，DO迅速升高，控制器会自动补糖；不行的话只能人工一直看着了。对了，你们以前最高做到多少的OD，产量怎么样
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