菌种衰退或污染后怎样进行菌种分离

zhangyq77

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为了使已经衰退或污染了的菌种恢复其原有的性状和能力，一般要进行纯种分离，将所得的若干单株，再进行糖化力或发酵力的比较测定。从经典的孟德尔遗传基本定律可知，各遗传性状在子代中逐渐分离，但在同一群体中由于遗传性的稳定性，其中也还存在着未衰退的部份，或者经过与环境的适应，使之具有较母株更优越的遗传性状。采用纯种分离技术，可以从衰退或污染的菌株中，得到性能优劣不同的纯种，然后，通过菌种性能的测定，得到生产所需要的菌株。常用的分离方法如下：
(一） 平面划线分离培养法
1．准备工作：
①培养皿灭菌：培养皿用纸包好，用湿热灭菌法灭菌后，再用于热灭菌法灭菌，现用现灭，不宜放置过久。
②培养基灭菌：每支试管装培养基10—15毫升，棉塞用纸包好，在蒸汽灭菌时避免和蒸汽直接接触；溶化琼脂时，最好用蒸汽，如用水浴溶化，要防止沸水打湿棉塞。
③试验材料：除按常规接种条件准备所需的仪器设备外，另取3—5毫升的无菌试管1支，新鲜供试菌株试管1支；无菌培养皿3套；玻璃铅笔1支。
2。划线分离：
①菌液稀释：取供试菌株和无菌水试管各1支，按无菌操作法挑取一接种耳打匀，制成菌悬液。
②划线：将试管培养基冷却至50℃，按无菌操作法将试管琼脂倾入培养皿。把培养皿编号(例如1、2、3)，待琼脂凝固后，仍用无菌纸包好。放入30℃温箱，蒸发表面的凝集水，经过2—3小时，使水汽集于皿盖，然后取出，按无菌操作法，在接近火焰处揭开培养皿，至恰好金属环伸入培养皿，蘸取一接种耳菌悬液，在皿盖的汽水中涂抹稀释，然后用接种耳在琼脂上自由划线。开始时可近乎是涂抹，然后一举划线，中间不要停顿，划成约6毫米间距的线条，迅速盖好皿益倒转培养皿。通常不用再蘸新菌液，迅速划二号三号培养皿，无疑可以得到越来越稀的单个菌落。
③培养：将所有的培养皿倒置，用无菌纸包好，在指定的温度下培养，待菌落长成后挑取单个菌落，移接于新的斜面，即得单株纯种微生物。以上方法仅适于细菌和酵母分离。
(二) 平面稀释琼脂倾注分离法
1．准备工作；
见划线分离法。但培养基的酸度可稍大，至琼脂不因酸度太高而不凝固为止。
2．分离操作：
以曲霉为例。将无菌水、无菌琼脂试管、无菌培养皿分别编号为1、2、3。琼脂试管在蒸汽或水浴上溶化并冷却至55℃，移入接种室55℃水浴保温。按无菌操作法取供试曲霉菌株一接种耳于无菌水1号试管中，摇匀并洗吸管三次，在吸取1毫升菌悬液于2号无菌水试管中，用同样方法洗吸管后摇匀，依次稀释第三支无菌水试管。先吸取3号无菌水试管制备的菌悬液1毫升于3号琼脂试管中，迅速摇匀，或用手搓试管使菌液均匀，注意不要使棉塞沾有培养基，立即氢入3号培养皿；按同样的方法顺次吸取2号菌悬液于2号琼脂试管，例入2号培养皿，直至做完l号培养皿为止。待琼脂凝固后倒转培养皿，用无菌纸包好，送入30℃温箱中培养，通常三支试管即可得到单菌落。
本法适用于细菌、酵母、霉菌等多种微生物。按本法的原理，将菌种定量，无菌水定容。例如，取曲种1克，无菌水99毫克或9毫升，可分别得到100、1000、1000、10000……的稀释倍数，如法倾入培养皿，待菌落全部长成后，进行微生物计数。一般每个培养皿有细菌菌落60—80个，酵母菌落40—60个，霉菌菌落20—30个即可。数菌落时一律用玻璃铅笔圈位，三个同一稀释度的平行试验菌落，误差不得超过10％。取其平均数，则微生物的细胞数(个／克样品)，等于菌落平均数×稀释倍数。
3．挑取单菌落：
将分离好的培养皿菌株，培养24、36、48……小时后，取出观察菌落生长情况。对于霉菌，常常是挑取幼年的菌落，即菌落刚露出生长物，连同琼脂一起挖出，移植于新的斜面培养基上，要多挑几株培养，用于糖化力的比较测定和取舍。也可在菌落长成后，挑取需要的菌落进行培养，但这样做往往因菌落扩张，而有碍单株的挑取。为了防止菌落扩张，可在琼脂培养基内加0.02％的去氧胆酸钠，或少许山梨糖，或硫酸十二酯等，加以限制。
(三) 纯种的分离
在纯种分离工作中，为了获得纯种，通常采用各种条件以控制杂苗的繁殖。主要采取的方法，是利用分离微生物的各种特性，发展所需要的纯种微生物，抑制有害微生物。操作要求如下：
1．营养条件的控制：
例如，分离曲霉用察氏培养基，控制其营养在最低限度，防止菌落的过份扩张，分离酵母用麦芽汁琼脂，不仅有利于酵母生长，而且能限制芽孢杆菌的扩展，还可以根据所分离菌种，能同化某些碳源或氮源的特点，限制其它杂菌的生长，如分离汉逊酵母以乙醇为唯一碳源等。
2．酸碱度的控制：
如分离霉菌，在培养基中加入乳酸，可以控制杂菌的生长。
3．特殊生理特性的控制：
如分离酵母菌，可利用酵母耐酒精的特性，在培养基中加入2％以上的乙醇，以抑制许多其它微生物的生长。典型者如红曲霉分离，可加乳酸至1％以上，加酒精至8％（V/V）。从严重污染物中分离纯种，采用特殊抑制剂的方法很多，如分离放线菌时，加入苯酚数滴，可抑制霉菌生
长；青霉素对格兰氏阳性菌有抑制作用，而对格兰氏阴性却作用甚微；四环素能抑制细菌，但对酵母、霉菌则很少有抑制作用，制霉菌素、灰黄霉素，对酵母、霉菌都有抑制作用，而不能抑制细菌和放线茵。芽孢杆菌的污染，常常给菌种培养带来极大的困难。为了抑制大多数芽孢杆菌的生长，不防碍霉菌的繁殖，需要在分离培养基中加入选择性的防腐剂。G.smith发现在培养基里加入玫瑰红(四氯、四碘萤光素）是非常有效的，其加入量是每升培养基加0.035克。在培养基灭菌后，可以不必加抗菌素。假如需要的话，玫瑰红在培养基里的浓度可以增加到每升0.067克，这个浓度可发挥显著的抗扩展作用，超过这个浓度，霉菌也要受到抑制。下面三个培养基可以作为分离霉菌抗细菌的培养基：
①Littman氏培养基(1947)，
葡萄糖    1.0％
蛋白胨    1.0％
牛胆汁    1.5％
结晶紫    1∶100，000
链霉素    30单位／毫升
水        l00毫升。
培养基先在不加链霉素时制成，用一般方法灭菌，冷却到50℃，用无菌生理盐水(0.85％)配成链霉素，在培养基 倒入培养皿前加入。培养基中的牛胆汁可防止霉菌菌落扩张。
②G.smith氏培养基：
葡萄糖       10克
NaNO3        1克
K2HPO4       1克
琼 脂        1.5克
玫瑰红       0.067克
20％土豆汁   1000毫升。
③Cooke氏培养基；
葡萄糖       10克
蛋白胨       10克
KH2PO4       1克
MgSO4•7H2O   0.5克
琼 脂        20克
玫瑰红       0.035克
水           1000毫升
金霉素       35微克
金霉素在培养基灭菌并冷却后，倒入培养皿前加入