发酵培养基

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3.发酵培养基如何配制？

首先需了解微生物需要的营养物质。

（1）微生物需要的营养物质

营养物质应满足微生物的生长、繁殖和完成各种生理活动的需要。它们的作用可概括为形成结构（参与细胞组成）、提供能量和调节作用（构成酶的活性和物质运输系统）。

微生物的营养物质有六大类要素，即水、碳源、氮源、无机盐、生长因子和能源。

① 水

水是微生物的重要组成部分，在代谢中占有重要地位。水在细胞中有两种存在形式：结合水和游离水。结合水与溶质或其他分子结合在一起，很难加以利用。游离水（或称为非结合水）则可以被微生物利用。

② 碳源

碳在细胞的干物质中约占50%，所以微生物对碳的需求最大。凡是作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源的营养物质，称为碳源。

作为微生物营养的碳源物质种类很多，从简单的无机物（CO2、碳酸盐）到复杂的有机含碳化合物（糖、糖的衍生物、脂类、醇类、有机酸、芳香化合物及各种含碳化合物等）。但不同微生物利用碳源的能力不同，假单孢菌属可利用90种以上的碳源，甲烷氧化菌仅利用两种有机物：甲烷和甲醇，某些纤维素分解菌只能利用纤维素。

大多数微生物是异养型，以有机化合物为碳源。能够利用的碳源种类很多，其中糖类是最好的碳源。

异养微生物将碳源在体内经一系列复杂的化学反应，最终用于构成细胞物质，或为机体提供生理活动所需的能量。所以，碳源往往也是能源物质。

自养菌以CO2、碳酸盐为唯一或主要的碳源。CO2是被彻底氧化的物质，其转化成细胞成分是一个还原过程。因此，这类微生物同时需要从光或其他无机物氧化获得能量。这类微生物的碳源和能源分别属于不同物质。

③ 氮源

凡是构成微生物细胞的物质或代谢产物中氮元素来源的营养物质，称为氮源。细胞干物质中氮的含量仅次于碳和氧。氮是组成核酸和蛋白质的重要元素，氮对微生物的生长发育有着重要作用。从分子态的N2到复杂的含氮化合物都能够被不同微生物所利用，而不同类型的微生物能够利用的氮源差异较大。

固氮微生物能利用分子态N2合成自己需要的氨基酸和蛋白质，也能利用无机氮和有机氮化物，但在这种情况下，它们便失去了固氮能力。此外，有些光合细菌、蓝藻和真菌也有固氮作用。

许多腐生细菌和动植物的病原菌不能固氮，一般利用铵盐或其他含氮盐作氮源。硝酸盐必须先还原为NH+4后，才能用于生物合成。以无机氮化物为唯一氮源的微生物都能利用铵盐，但它们并不都能利用硝酸盐。

有机氮源有蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米浆等，工业上能够用黄豆饼粉、花生饼粉和鱼粉等作为氮源。有机氮源中的氮往往是蛋白质或其降解产物。

氮源一般只提供合成细胞质和细胞中其他结构的原料，不作为能源。只有少数细菌，如硝化细菌利用铵盐、硝酸盐作氮源和能源。

④ 无机盐

无机盐也是微生物生长所不可缺少的营养物质。其主要功能是：① 构成细胞的组成成分；② 作为酶的组成成分；③ 维持酶的活性；④ 调节细胞的渗透压、氢离子浓度和氧化还原电位；⑤ 作为某些自氧菌的能源。

磷、硫、钾、钠、钙、镁等盐参与细胞结构组成，并与能量转移、细胞透性调节功能有关。微生物对它们的需求量较大（10-4～10-3 mol/L），称为“宏量元素”。没有它们，微生物就无法生长。铁、锰、铜、钴、锌、钼等盐一般是酶的辅因子，需求量不大（10-8～10-6 mol/L），所以，称为“微量元素”。不同微生物对以上各种元素的需求量各不相同。铁元素介于宏量和微量元素之间。

在配制培养基时，可通过添加有关化学试剂来补充宏量元素，其中首选是K2HPO4和MgSO4，它们可提供需要量很大的元素：K、P、S和Mg。微量元素在一些化学试剂、天然水和天然培养基组分中都以杂质等状态存在，在玻璃器皿等实验用品上也有少量存在，所以，不必另行加入。

⑤ 生长因子

一些异养型微生物在一般碳源、氮源和无机盐的培养基中培养不能生长或生长较差。当在培养基中加入某些组织（或细胞）提取液时，这些微生物就生长良好，说明这些组织或细胞中含有这些微生物生长所必须的营养因子，这些因子称为生长因子。

生长因子可定义为：某些微生物本身不能从普通的碳源、氮源合成，需要额外少量加入才能满足需要的有机物质，包括氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶及其衍生物，有时也包括一些脂肪酸及其他膜成分。

各种微生物所需的生长因子不同，有的需要多种，有的仅需要一种，有的则不需要。一种微生物所需的生长因子也会随培养条件的变化而变化，如在培养基中是否有前体物质、通气条件、pH和温度等条件，都会影响微生物对生长因子的需求。

从自然界直接分离的任何微生物，在其发生营养缺陷突变前的菌株，均称为该微生物的野生型。绝大多数野生型菌株只需简单的碳源和氮源等就能生长，不需要添加生长因子；经人工诱变后，常会丧失合成某种营养物质的能力，在这些菌株生长的培养基中，必须添加某种氨基酸、嘌呤、嘧啶或维生素等生长因子。

⑥ 能源

能源是指为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。微生物的能源谱如下：



化能异养型微生物的能源即碳源；化能自养型微生物的能源都是还原态的无机物，如NH4+、NO2-、S、H2S、H2、Fe2+等，它们分别属于硝化细菌、亚硝酸细菌、硫化细菌、硫细菌、氢细菌和铁细菌等。

一种营养物常有一种以上营养要素的功能，即除单功能营养物外，还有双功能，甚至三功能营养物。辐射能是单功能；还原态无机养分常是双功能的（NH4+既是硝化细菌的能源，又是它的氮源）甚至是三功能的（能源、氮源和碳源）；有机物常有双功能或三功能作用。

（2）配制培养基必须遵循的原则

微生物的培养基通常指人工配制的适合微生物生长繁殖，或积累代谢产物的营养基质。广义上说，凡是支持微生物生长繁殖的介质或材料，均可作为微生物的培养基。一个适当的培养基配方，对发酵产品的产量和质量有着极大的影响。

针对不同微生物，不同的营养要求，可以有不同的培养基。但它们的配制必须遵循一定原则。

① 营养物质应满足微生物的需要。不同营养类型的微生物对营养的需求差异很大，应根据菌种对各营养要素的不同要求进行配制。

② 营养物的浓度及配比应恰当。营养物浓度太低，不能满足微生物生长的需要；浓度太高，又会抑制微生物生长。

糖和盐浓度高有抑菌作用。

碳氮比（C∶N，以还原糖含量与粗蛋白含量的比值表示）：一般培养基为C∶N=100∶0.5～2。

在设计培养基配比时，还应考虑避免培养基中各成分之间的相互作用，如蛋白胨、酵母膏中含有磷酸盐时，会与培养基中钙或镁离子在加热时发生沉淀作用；在高温下，还原糖也会与蛋白质或氨基酸相互作用而产生褐色物质。

③ 物理、化学条件适宜。pH：各种微生物均有其生长繁殖的最适pH，细菌为7.0～8.0，放线菌为7.5～8.5，酵母为3.8～6.0，霉菌为4.0～5.8。对于具体的微生物菌种，都有各自的特定的最适pH范围，有时会大大突破上述界限。在微生物生长繁殖过程中，会产生能够引起培养基的pH改变的代谢产物，尤其是不少微生物有很强的产酸能力，如不适当地加以调节，就会抑制甚至于杀死其自身。在设计培养基时，要考虑培养基的pH调节能力。一般应加入缓冲液或CaCO3，使培养基的pH稳定。

其他：培养基的其他理化指标，如水活度、渗透压也会影响微生物的培养。在配制培养基时，通常不必测定这些指标，因为培养基中各种成分及其浓度等指标的优化，已间接地确定了培养基的水活度和渗透压。此外，各种微生物培养基的氧化还原电位等也有不同的要求。

④ 培养目的：培养基的成分直接影响培养目标。在设计培养基时，必须考虑是要培养菌体，还是要积累菌体代谢产物；是实验室培养，还是大规模发酵等问题。

用于培养菌体的种子培养基营养成分应丰富，氮源含量宜高，即碳氮比值应低；相反，用于大量积累代谢产物的发酵培养基，氮源应比种子培养基稍低；当然，若目的产物是含氮化合物时，有时还应该提高培养基的氮源含量。

在设计培养基时，还应该特别考虑到代谢产物是初级代谢产物，还是次级代谢产物。如果是次级代谢产物，还要考虑是否需加入特殊元素（如维生素B12中Co）或特殊的前体物质（如生产青霉素G时，应加入苯乙酸）。在设计培养基，尤其是大规模发酵生产用的培养基时，还应该重视培养基组分的来源和价格，应该优先选择来源广、价格低廉的培养基。

（3）几种培养基的配制原则

① 种子培养基：适用于微生物菌体生长的培养基，目的是为下一步发酵提供数量较多，强壮而整齐的种子细胞。一般要求氮源、维生素丰富，原料要精。

② 发酵培养基：用于生产预定发酵产物的培养基，一般的发酵产物以碳源为主要元素。发酵培养基中的碳源含量往往高于种子培养基。如果产物的含氮量高，应增加氮源。在大规模生产时，原料应该价廉易得，还应有利于下游的分离提取工作。

③ 繁殖和保藏培养基：主要用于菌种保藏，大部分是斜面培养基。对营养缺陷型或结构类似物抗性菌株或抗生素抗性菌株来说，可适当加入特定的对应成分，提供压力。

④ 基本培养基：又称最低限度培养基，指能够满足某菌种的野生型菌株最低营养要求的合成培养基。不同微生物的基本培养基很不相同，有的极为简单（大肠杆菌），有的极为复杂（乳酸菌、酵母或梭菌），需加生长因子和特殊营养。

⑤ 加富培养基：是在普通培养基中加入血、血清、动（植）物组织液或其他营养物（如生长因子）的一类营养丰富的培养基。主要用于某种或某类营养要求苛刻的异氧型微生物，或者用来选择性培养（分离、富集）某种微生物。具有助长某种微生物的生长，抑制其他微生物生长的功能。广义上讲，保藏和鉴别培养基也属于加富培养基。

⑥ 选择性培养基：根据某种或某类微生物的特殊营养要求，或对某些物理、化学条件的抗性而设计的培养基。目的是利用这种培养基把某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。一是根据某些微生物对碳源、氮源的需求而设计，二是根据某些微生物的物理和化学抗性而设计。如嗜酸、嗜碱、嗜盐、抗性微生物富集等。


7.有哪些因素会影响发酵生产？

发酵生产过程中，以下因素会影响发酵效果。

① 菌种  发酵是利用微生物来生产产品，因此菌种至关重要。现在工业上用于生产青霉素的微生物主要是青霉菌，生产味精的微生物是棒状杆菌，生产柠檬酸的微生物主要是黑曲霉。这是因为每一种微生物的代谢特征不同，它们产生特定产物的能力也不同。为了利用发酵生产所需的产物，不是随便拿来一个菌种就行。直接从自然界分离到的微生物不一定具有生产特定产物的能力，须在实验室里对几百株、数千株微生物进行筛选。即使得到了产生特定产物能力的菌株，其生产能力和性能也不见得能够满足生产的需要，还须经过诱变选育得到高产、性能优良的菌种。即使利用基因工程构建的具有特殊生产能力的工程菌，都还要对其进行仔细研究，全面了解产生产物的规律、影响菌株产生产物的各种因素和它们之间的关系，以及控制办法，并在实验室里进行验证和扩大规模的验证，才能够用于生产。在大规模工业生产上有了优良的生产菌种还不够，必须通过适当的措施提供足够量的种子。

② 发酵培养基  现在大规模工业发酵产品的生产，多采用液体培养基进行深层发酵。使用的培养基必须满足微生物细胞生长、繁殖的需要，因为没有大量的细胞就不可能产生大量的产物；但是细胞的过分生长会消耗大量的营养物，有时又会影响细胞的生产能力，会使产物的产量和产率下降。使用的培养基还必须有利于微生物大量合成产物。因此，培养基的组成十分关键。

③ 纯种发酵与灭菌  现代发酵工业绝大多数采用纯种发酵，可以保证高产及生产过程和产品质量的稳定。污染是发酵工业的大敌，它会使发酵失败，造成巨大损失。因此，灭菌和无菌操作成为发酵工业的重要环节。

发酵涉及到的设备，如发酵罐、空气过滤系统、管道、阀门、取样设备等均必须用120 ℃以上的高压蒸汽进行彻底灭菌，把存在的所有微生物杀死。配制好的培养基在进入发酵罐之前要加热到120 ℃以上，进行灭菌，或进入时采用连续高温灭菌的方法进行灭菌，即将与发酵关联的所有系统进行灭菌，然后使系统降温到发酵温度后，接入种子，开始发酵。只有这样才能保证接入的菌种不受污染，进行正常发酵。如果灭菌不彻底，哪怕有很少量的杂菌没有被杀死，也会在发酵过程中大量繁殖，造成污染，使发酵失败。

④ 温度对微生物生长的影响  温度主要是通过影响微生物细胞内生物大分子的活性来影响微生物的生命活动。一方面，随着温度的升高，细胞内的酶反应速度加快；另一方面，随着温度的进一步增高，生物活性物质（蛋白质，核酸等）发生变性，细胞功能下降，甚至死亡。所以，每种微生物都有个最适生长温度。作为整体，微生物可在-10～95 ℃范围中生长，极端下限为-30 ℃，极端上限为105～300 ℃。但对于某一种特定的微生物来说，则只能在一定的温度范围内生长。温度下限和上限分别称为微生物的最低和最高生长温度。当低于或高于最低或最高生长温度，微生物就停止生长，甚至死亡。

需要指出的是，微生物不同的生理活动需要在不同的温度条件下进行，所以，生长速率、发酵速度、代谢产物积累速度的最适温度往往不在同一温度下。例如，乳酸链球菌在34 ℃时繁殖速度最快，25～30 ℃时细胞产量最高，40 ℃时发酵速度最快，30 ℃时乳酸产量最高。其他微生物也有类似特点。

在较高温度下，细胞分裂虽然较快，但维持时间不长，容易老化；相反，在较低温度下，细胞分裂虽然较慢，但维持时间长，细胞的总产量反而较高。

同样，发酵速度与代谢产物积累之间也有类似关系。研究不同微生物在生长或积累代谢产物阶段时的最适温度，采用变温发酵，对提高发酵生产效率具有重要意义。

⑤ pH对微生物生长的影响  培养基的pH对微生物生长的影响主要是引起细胞膜电荷变化，以及影响营养物离子化程度，从而影响微生物对营养物的吸收；pH也会影响生物活性物质，如酶的活性。

与温度对微生物的影响类似，微生物存在最低生长pH、最适生长pH和最高生长pH。不同微生物对环境pH适应的范围不同。一般微生物生长的最适pH在4.0～9.0范围内。真菌生长的范围宽，细菌较窄（3～4pH单位），细菌、放线菌一般适应于中性偏碱性环境，而酵母、霉菌适应于偏酸性环境。最适生长pH偏酸性的微生物，称为嗜酸性微生物；其中不能在中性环境生长的称专性嗜酸微生物，如乳酸杆菌和假单胞杆菌；既能适应酸性，也能在中性环境中生长的称兼性嗜酸菌；最适生长pH偏碱性的称嗜碱性微生物，如链霉菌。

同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中，对环境pH也有不同要求。如丙酮丁醇梭菌在pH为5.5～7.0时，以菌体生长繁殖为主；pH为4.3～5.3时，才进行丙酮丁醇发酵。

同一种微生物由于培养环境pH不同，可能积累不同的代谢产物。如黑曲霉在pH为2～3的环境中发酵蔗糖，产物以柠檬酸为主，只产极少量的草酸；当pH接近中性时，则大量产生草酸，而柠檬酸产量很低。又如酵母菌在最适pH时，进行乙醇发酵，不产生甘油和醋酸；如果环境pH大于8，发酵产物除乙醇外，还有甘油和醋酸。因此，在发酵过程中，根据不同目的，采用变pH发酵，可以控制产物和生产效率。

大多数微生物能分解糖，产生酸性物质，造成pH下降。少数微生物能分解尿素成氨，使环境pH上升，蛋白质脱羧反应也会使pH上升。所以，微生物的代谢活动会改变环境pH，影响其生存。pH变化的程度与培养基的C/N比有关，C/N比高，则pH下降明显；反之，pH有可能会上升。有时为了控制发酵液的pH需要通过加入酸碱进行调节。

⑥ 溶氧的影响  工业上大部分为好氧发酵，如抗生素、氨基酸、维生素、多糖、有机酸（细菌发酵生产乳酸例外）等发酵均需要往发酵液中通入无菌空气，以满足微生物生长代谢过程对氧的需求；而酒精、丙酮、丁醇和乳酸的细菌发酵为厌氧发酵，发酵过程不需要氧。

对于好氧发酵的工业生产，如何保证发酵液中氧的供给，满足微生物对氧的需求，使氧的供、需矛盾不会成为生产的限制因素，是稳定和提高生产、降低成本的关键之一。在发酵过程中氧的供给够不够，只凭通气量的大小是难以确定的。由于发酵过程随着微生物的繁殖、营养物的消耗和代谢产物的积累，发酵液的物理、化学和生物学性质均会发生改变，这时尽管通气量不变，氧在培养基中的溶解速度和浓度均会发生变化。为了了解和掌握氧对发酵的影响，最简单而有效的办法是就地测定发酵液中的氧浓度，从氧浓度的变化情况了解氧的供需规律和它的变化对生产的影响。

在好氧发酵时，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。为什么氧会成为限制因素，而不是其他营养物？关键是与其他营养物相比，氧在溶液中的溶解度和溶解速度很低，如果不采取适当措施，氧的供给就会成为限制因素。

微生物在不同发酵阶段，因其生长、代谢水平的变化，对氧的需求量也有变化，因此，控制发酵液的溶氧可以达到提高生产水平的目的。

发酵液中溶氧浓度可以通过控制通气量、罐压、搅拌速度等控制氧的溶解速度和浓度。

可以看出，发酵过程对周围环境的物理和化学条件十分敏感，任何一种微生物发酵均需要适当的温度、pH、溶解氧、营养物等，保证最适的发酵条件是发酵成功获得高产产品的关键。

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