总氮量的测定—凯氏(Micro—Kjeldahl)定氮法

李晶

总氮量的测定——凯氏(Micro—Kjeldahl)定氮法

一、目的
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
二、原理
    常用凯氏定氮法测定天然有机物(如蛋白质、核酸及氨基酸等)的含氮量。
    含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢2元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。甘氨酸的消化过程可表示如下：
  CH2NH2COOH+3H2SO4，一2CO2+3SO2十4H2O十NH3
    2NH3+H2SO4一(NH4)2SO4
    浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的总氮量。
三、试剂
1、消化液(过氧化氢：浓硫酸 ：= 3：2：1)    200mL   
2、粉末硫酸钾—硫酸铜混合物               16g
K2S04与CuS04•5H201~2 3：1配比研磨混合
3、30％氢氧化钠溶液                       1 000 mL
4、2％硼酸溶液
5、标准盐酸溶液(约0．01 mol／L)
6、混合指示剂(田氏指示剂)   
    由50mL0．1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL0．1％甲基红l醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。
7、市售标准面粉和富强粉① 各2g
四、操作方法
1、凯氏定氮仪的构造和安装  凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反应管及冷凝器3部分组成。
    蒸汽发生器包括电炉及一个1-2L（升）容积的烧瓶。蒸汽发生器借橡皮管与反应管相连，反应管上端有一个玻璃杯，其上端通过反应室外层与蒸汽发生器相连，下端靠近反应室的底部。反应室外层下端有一开口，上有一皮管夹，由此可放出冷凝水及反应废液。反应产生的氨可通过反应室上端细管及冷凝器通到吸收瓶中，反应管及冷凝器之间借磨口连接起来，防止漏气。安装仪器时，先将冷凝器垂直地固定在铁支台上，冷凝器下端不要距离实验台太近，以免放不下吸收瓶。然后将反应管通过磨口连接与冷凝器相连，根据仪器本身的角度将反应管固定在另一铁支台上。这一点务须注意，否则容易引起氨的散失及反应室上端弯管折断。然后将蒸汽发生器放在电炉上，并用橡皮管把蒸汽发生器与反应管连接起来。安装完毕后，不得轻易移动，以免仪器损坏。
2、样品处理  某一固体样品中的含氮量是用100g该物质(干重)中所含氮的g数来表示(％)。因此在定氮前，应先将固体样品中的水分除掉。一般样品烘干的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。
在称量瓶中称人一定量磨细的样品，然后置于105℃的烘箱内干燥4小时。用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。
若样品为液体(如血清等)，可取一定体积样品直接消化测定。
精确称取0.1 g左右的干燥面粉作为本实验的样品。
3、消化取4个100mL凯氏烧瓶或50mL消化管并标号。各加l颗玻璃珠，在1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂(K2S04—CuS04•5H2O)200 mg，消化液5 mL。注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3及4号瓶中各加0，1 mL蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放—漏斗，在通风橱内的电炉上消化。
当消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。消化完毕，等烧瓶中溶物冷却后，加蒸馏水10 mL。(注意慢加，随加随摇)。冷却后将瓶中溶物倾人50 mL的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并人量瓶。用水稀释到刻度，混匀备用。
4．蒸馏(1)蒸馏器的洗涤  蒸汽发生器中盛有用几滴硫酸酸化的蒸馏水。关闭皮管夹，将蒸汽发生器中的水烧开，让蒸汽通过整个仪器。约15分钟后，在冷凝器下端放一个盛有5 mL2％硼酸溶液和1—2滴指示剂混合液的锥形瓶。位置倾斜，冷凝器下端应完全浸没在液体中，继续蒸汽洗涤1—2分钟，观察锥形瓶内的溶液是否变色，如不变色则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。向下移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约1 cm，继续通蒸汽1分钟。用水冲洗冷凝管口后用手捏紧橡皮管。此时由于反应室外层蒸汽冷缩，压力减低，反应室内凝结的水可自动吸出进入反应室外层。最后打开皮管夹，将废水排出。
(2)蒸馏  取50 mL锥形瓶数个，各加5 mL硼酸和1~2滴指示剂，溶液呈紫色，用表面皿覆盖备用。
用吸管取10 mL消化液，细心地由蒸馏器小玻杯注入反应室，塞紧棒状玻塞。将一个含有硼酸和指示剂的锥形瓶放在冷凝器下，使冷凝器下端浸没在液体内。
用量筒取30％的氢氧化钠溶液10mL放人小玻璃杯，轻提棒状玻璃塞使之流入反应室(为了防止冷凝管倒吸，液体流入反应室必须缓慢)。尚未完全流人时，将玻璃塞盖紧，向玻璃杯中加入蒸馏水约5 mL。再轻提玻璃塞，使一半蒸馏水慢慢流人反应室，一半留在玻璃杯中作水封。加热水蒸汽发生器，沸腾后夹紧皮管夹，开始蒸馏。此时锥形瓶中的酸溶液由紫色变成绿色。自变色时起记时，蒸馏3—5分钟。移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管约1 cm，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外面。继续蒸馏1分钟，移开锥形瓶，用表面皿覆盖锥形瓶。
    蒸馏完毕后，须将反应室洗涤干净。在小玻璃杯中倒入蒸馏水，待蒸汽很足、反应室外层温度很高时，一手轻提棒状玻璃塞使冷水流人反应室，同时立即用另一只手捏紧橡皮管，则反应室外层内蒸汽冷缩，可将反应室中残液自动吸出，再用蒸馏水自玻璃杯倒人反应室，重复上述操作。如此冲洗几次后，将皮管夹打开，将反应室外层中废液排出。再继续下一个蒸馏操作。
待样品和空白消化液均蒸馏完毕后，同时进行滴定。   
(3)滴定  全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。
(4)计算
总氮量=C(V1-V2)×0.014/w × 消化液量(ml) / 滴定消耗用液量(ml)
c为标准盐酸溶液摩尔浓度；
V1为滴定样品用去的盐酸溶液平均mL数；
V2为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均mL数；w为样品重量(g)。
14为氮的相对量子质量。
若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则，
样品中蛋白质含量(％)二总氮量×6．25
若样品中除有蛋白质外，尚有其他含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。
    蛋白氮=总氮—非蛋白氮
    蛋白质含量(g％)二蛋白氮×6.25
改进型凯氏定氮仪
改进型凯氏定氮装置是在传统凯氏定氮装置的结构基础上改装而成，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。 1．改进型凯氏蒸馏装置的结构。可分成3部分来叙述：
(1)水蒸汽发生器和反应室
(2)冷凝器和通气室
(3)排水柱
2、样品处理
3、消化
4、蒸馏
(1)蒸馏器的洗涤  接通冷凝水，先向蒸汽发生器中加入一定量的水(以排水口高度为宜)用酒精灯将其加热烧开。然后将蒸馏水由加样室加入反应室，水即自动吸出，或者将酒精灯移开片刻，或者打开自由夹，使冷水进入蒸汽发生器，都可使反应室中的水自动吸出，如此反复清洗3-5次。清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5 mL，2％硼酸溶液和1～2滴指示剂的混合液。蒸馏数分钟后，观察锥形瓶内溶液是否变色，如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。
(2)蒸馏  取50 mL锥形瓶数个，各加入5 mL 2％硼  酸溶液和1—2滴指示剂，溶液呈淡紫色，用表面皿覆盖备用。
关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将一个盛有硼酸和指示剂溶液的锥形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸没在液体内。
用移液管取5 mL消化液，细心地由加样室下端加入反应室，随后将已准备好的30％NaOH溶液5mL加入，关闭自由夹，在加样漏斗中加少量水做水封。
关闭自由夹打开冷凝水(注意不要过快过猛，以免水溢出)。
当观察到锥形瓶中的溶液由紫变绿时(约2—3分钟)，开始计时，蒸馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏1分钟，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。打开自由夹，将水放出，再加热，再清洗，如此3～5次。最后将自由夹同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉。关闭夹子，再使蒸汽通过整个装置数分钟后，继续下一次蒸馏。待样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进行滴定。
（3）滴定
（4）计算

孔夫之

没甚必要尽量不要测总氮，太危险了，搞不好就毁容了

jsf

消化这一步比较麻烦！我们只测氨基氮。

jubaner_333

好详细啊