最近遇到一个重组大肠杆菌的保藏问题，大家来分析一下

wzidiotzy

问题是这样的：
  种子扩大培养一级摇瓶时，比以前长得慢好多了（以前7h后OD600可以长到1.0左右，
现在7h只能长到0.3左右），我分析了和平常的培养条件步骤没有差别，
前段时间的一批种子也出现了同样的情况。（一批种子大概一两个月后就会出现这样的情况）
  
种子的置备过程如下：
  用的是抗四环素的基因工程菌（大肠杆菌），培养基为LB，加入的四环素浓度75ug/ml，
培养至OD1.5左右时，取30％的甘油＋种子液各0.5ml入1.5ml离心管，
摇匀后直接放于负75度冰箱保藏。

  原因是不是种子在置备和保藏时不够恰当，使得种子在保藏过程中存活率下降了或者是
导致质粒丢失引起退化呢。
  
我想大家在以下几方面来指点我一下，有做细菌较多的朋友谈谈你们的宝贵经验。
  1 加入抗生素对细菌保藏的影响有多大，抗生素浓度的把握
  2 若将种子液经离心去上清后加入新鲜培养液，再与甘油混和保藏，会有利于包藏吗
  3 适宜的种子OD的判断，对数生长期时置备
  4 冷冻和解冻时温度和时间的把握
      冷冻①直接负75度 ②先负20度再负75度 ③先4度5分钟再负75度
      解冻①常温解冻 ②37度解冻
      这个菌种感觉是冷冻时先4度5分钟再负75度，37度解冻较好

再就是我准备检测一下保藏的甘油管中种子的存活率，直接涂平板怎么样，大家有什么好的建议吗。

wzidiotzy

没人回答呢？

zcg0216

楼主好像不像是在问问题，我根据楼主的描述就获得不少信息。我也是刚刚用甘油管保存了一下基因工程抗性菌，效果不知道呢。准备拿出来一个解冻试试。不过有几篇文章，可以参考一下的  菌种的甘油管保藏方法

三可

种子的冻藏和复苏要遵循的原则是缓冻速融。就是说要慢慢的降温，复苏时尽快完成解冻。
我在学校是先4℃冷藏过夜再保藏到-20℃冰箱，种子盒外面包着厚厚的报纸。若有-70℃冰箱，我想可以等-20℃冷冻一天后再移入。

liushuwen

保存时间长了，菌种活力下降
菌种复壮一次，再保存使用