大肠杆菌发酵质粒丢失

wbs1225

最近发现用大肠杆菌发酵，做了几次质粒丢失实验，发现发酵后期大量质粒丢失，有没有什么好的解决措施啊？

细履平沙

首先需要排除是不是保种问题，甘油浓度过高，推荐在10％
发生在培养过程中，污染是第一要确认去排除的，建议镜检。
再者，培养基的问题，特别是维生素和抗生素质量。

另外提别提醒：
实验过程中，菌种的保存十分重要，特别是那些经过筛选得到的带有阳性质粒的菌株。筛选出来的阳性菌株经常需要转接，而转接过程一方面要防止污染，同时还要防止质粒的丢失。一个最常用的措施是利用抗生素抑制那些丢失质粒的变异菌落的生长，但实际在菌落生长过程中抗生素会失效，导致杂菌污染而影响质粒的收率或蛋白质的表达量。因此注意保存原始菌是非常重要的，必要时在转接前对保存菌进行画线，挑出好的单菌落进行转接，并再保存一份新的菌种。对这种常规操作不可掉以轻心，否则损失是难以弥补的。

细履平沙

1.不管加不加抗生素，传代次数多了质粒拷贝数都会减少，蛋白表达水平都会下降
2.保存质粒是最安全保险的方法，每次用时可以重新转化
3.由于感受态制做时每一个菌所处的生理周期不同，所以转化后各个菌的表达水平大致可分为5个水平层次
4.由于第三个原因，所以发酵用的种子最好要经过筛选
5.筛选出好的单菌落要尽快做成种子库
6.在做种子库时要尽量减少传代次数

细履平沙

以上贴子从其他网站上贴出来的，供参考。

wbs1225

谢谢总版主，我的的菌都是由25%甘油管在抗性平板划线再跳单克隆到摇瓶，然后直接接罐发酵（罐小），但是发酵时间在20h左右质粒就大量丢失。

圣斗士

10%的甘油管直接接种到摇瓶，减少传代次数。 高密度发酵与高表达是一对矛盾体，两者不可兼得