甲醇与发酵相关知识

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诱导作用[size=; font-size: 1em,1em]       当甲醇既作为诱导剂，又作为碳源时，应该对甲醇的加量进行严格控制，需要平衡生长和生产的关系。因此发酵技术人员一般不会将甲醇作为唯一碳源，而是根据优化的结果另选择一种更容易代谢的C源与之组合，如甘油或山梨醇，这样既能够满足生产的需要，也不容易导致甲醇超标，产生毒性。
        以毕赤酵母为例，解释毒性的来源：当[size=; font-size: 1em,1em]以甲醇作为唯一碳源表达外源蛋白时，一般认为通过甲醛异化途径为提供功能性细胞和目标蛋白的合成提供能量，该途径在为蛋白合成提供能量的同时，中间代谢产物甲醛等脱离过氧化物酶体(Peroxisome) 进入到液胞内，会对细胞产生毒害作用，导致目标蛋白的浓度或活性低、高效表达难以长时间地持续下去。

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在培养过程中，当基础料中的甘油耗尽后，此时DO 急剧上升，开始流加浓度为50％甘油，并以维持DO 在40％为依据控制甘油补料速率，当细胞干重 (DCW) 到达30 后停止补甘油。进入甲醇诱导期后，以在线监控发酵液中的甲醇残留浓度来控制甲醇流加速率，分别以0.25％、0.5％、0.75％三个甲醇浓度进行研究。诱导期间维持DO＞20％，当溶氧过低时通入富氧空气。通过氨水和酵母生长自身产酸控制甲醇诱导期的pH，诱导温度为25 ℃。
    结果表明：在低甲醇浓度下却可以有效避免聚合体的产生，由于甲醇既是细胞利用的碳源又是诱导剂，所以甲醇浓度的变化很容易使细胞的生理发生改变。
    引自《甲醇浓度对毕赤酵母表达重组人复合α 干扰素分离纯化得率的影响》

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细胞浓度达到120~130 g DCW/L 后甘油流加培养结束(30~32 h)，饥饿培养约30 min 耗尽残留甘油，30 ℃下同时添加甲醇和山梨醇培养基。通过甲醇在线测量和控制装置将甲醇浓度控制在10 g/L 左右，使用蠕动泵以不同的设定转速恒速流加山梨醇，控制其残留浓度低于0.5 g/L。
       结果表明，降低诱导温度 (30 ℃→20 ℃)和采用甲醇/山梨醇共混流加策略 (30 ℃) 都能提高pIFN-α 的表达水平，但甲醇/山梨醇共混流加诱导对总蛋白浓度和pIFN-α 抗病毒活性水平的提高幅度更为显著。
       引自汪汇慧《甲醇/山梨醇共混流加诱导改变毕赤酵母生产猪α干扰素过程的代谢产能途径强化发酵性能》

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在酸性环境条件下，利用高锰酸钾氧化成甲醛，再借助甲醛与变色酸作用生成紫色化合物，进而采用比色法达到测定气体中的甲醇含量的目的”。该法速度快、操作简便。测定过程中乙醇与丙酮的干扰一直难于找到理想的消除方，结果则会出现偏高。因此这种方法特异性较差。
引自《关于“变色酸分光光度法测定气体中甲醇”方法改进的研究》

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甲醇溶液中的CH3对称伸缩峰(2843 cm-1 )的激光拉曼光谱峰, 同时以本底溶液水为内标物, 组成相对强度, 对溶液中的甲醇含量进行了测定研究, 建立了激光拉曼光谱直接法测定甲醇含量的方法, 其线性范围为5% ～ 40%, 线性相关系数为0.9966, 检出限为0.29%。并对模拟样品和制备液相色谱待回收废液进行了甲醇浓度的测定, 其浓度分别为13.7%、9.41%和58.8%, RSD分别为0.78%、0.75%和1.34%。该方法简单、操作方便, 无需添加其它任何化学试剂等优点。
引自刘文涵《激光拉曼光谱内标法直接测定甲醇浓度》

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建立了多维气相色谱检测酒中甲醇含量的方法。采用自动进样器将酒类样品直接注入气相色谱进样口，依次经过非极性RTX-5ms 色谱柱和极性HP-INNOWax 色谱柱，由气相色谱质谱选择离子监测技术进行测定与确证。甲醇在1 ～ 10000 mg /L 范围内呈线性相关; 方法检出限为1 mg /L。各种酒类样品在5，50，250，400 和800 mg /L 添加水平时，平均回收率为91． 3% ～ 101． 9%，相对标准偏差为4． 5% ～ 8． 6%。本方法无需前处理，灵敏度高，选择性好，定性准确。但是本法需要用于多维气相色谱质谱联用仪，前期投入大，不适合一般企业。
引自伊雄海的《多维气相色谱法检测酒中甲醇》

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采用气相色谱仪，以氮气为载气，对各浓度标准样品进行分析。取得样品数据进行分析，标准样品出峰为单峰，且保留时间相同可知这个保留时间出的峰为甲醇峰。
    用毛细管气相色谱法检测发醇液中的甲醇，样品中各组分能一次有效分离。该法分析结果准确可靠，分析速度快，一个样品从取样到分析含量只有10分钟，在流加甲醇诱导的酵母表达系统中可以准确地控制甲醇的含量，从而可以提高外源蛋白的表达量。
引自张平《气相色谱法检测甲醇酵母表达系统中发酵液中甲醇的含量》

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从某化工厂生产和使用甲醇的车间周围土壤采集土样, 分离筛选出一种同化甲醇能力强的专性杆菌, 固定化后, 与极谱型氧电极组合, 制成甲醇微生物传感器。将该传感器与相匹配的电子测量系统及测量池系统组装成实验装置, 研究测试了甲醇微生物传感器的性能和实验条件, 测定了环境样品。结果表明, 传感器微生物膜的寿命、选择性、稳定性和测定实际样品的准确度等均获得比较理想的效果, 是一种快速、简便的微量甲醇测定技术。
引自孙裕生《用微生物传感器法测定甲醇的研究》

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采用固定化酶化学发光检测法测定甲醇的浓度,建立了一种在线监测甲醇酵母发酵诱导阶段发酵液中甲醇浓度的新方法.在选定的最佳条件下,甲醇浓度在0%～1.0%(V/V)范围内与化学发光强度呈良好的线性关系(R=0.9995),相对标准偏差(RSD)为1.9%(n=11),72 h内RSD为5.0%(0.2%甲醇溶液).该法可在线自动完成过滤、稀释、测定等操作,分析速度快,长期稳定性高,能满足在线监测甲醇酵母发酵液中甲醇浓度的要求.
引自彭珏《顺序注射固定化酶化学发光法在线检测甲醇酵母发酵液中的甲醇》