你可知道发酵罐四大可定量的补料方式及其优缺点吗？

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  补料分批发酵是最重要的一种生产模式，是指在无菌条件下向发酵系统中补加一定物料，维持生物生长和生产所需要的营养或前体，介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵生产模式。
        本文结合GMP最新要求和发酵的特点，归纳了四种常见的可定量的生物过程补料方式并简述了其优缺点：四种方式分别是火焰插针方式、可在线SIP的蠕动泵补料方式，以及基于流量计和计量杯的补料方式。
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01
知识背景
定量补料
    有几个涉及补料的发酵参数，如pH和泡沫控制，可通过PID自动反馈调节。除此之外，更多补料如C源，N源，前体，诱导物，抑制剂等，它们在添加前需要对多个参数进行相关性分析，往往不是一个，然后再根据经验规则制订补加策略。由于目前还没有一套可闭环控制的补料方案，所以需要不断的根据参数变化来修改策略。
    无论哪一种方式，都需要工艺人员掌握累积补料量和实时补料量，甚至对待它们要比测量的那些生理参数优先级还要高，因此补料的定量控制能力成了对发酵设备的基本要求。同时，补料除了符合定量之外，还要考虑无菌因素和法规要求。
法规要求
新版GMP规定：发酵过程需补料操作时要求在无菌操作条件下进行，应事先对补充的物料配制后补料前进行在位灭菌或过滤灭菌，应对补料管路进行灭菌保证无死角，应采用密闭或封闭系统进行补料。以上规定对食品和原料药生产涉及的发酵过程的补料进行规范，大大降低了因补料导致的质量风险。

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02
小规模生物过程补料
传统蠕动泵补料方式
①将配制好料液加到补料瓶a内，并用硅胶管d将补料瓶a和补料针组件e连接好，然后将补料针组件包上纱布和牛皮纸后，整体再放入灭菌锅内灭菌；
②将灭菌后的硅胶管d安装到蠕动泵c内；
③对接种环境进行消毒；
④在火焰保护下，将补料针刺穿补料组件上的硅胶塞，再旋紧补料针。
⑤打开发酵自控系统上的补料程序，进行自动补料。

优缺点：该工艺简单实用，虽然实际染菌率很低，却因为是敞口操作，没有合适的验证方案，经常不被GMP审核员认可，所以这种方法多见于试验室。
具有SIP功能的补料方式
具体操作流程如下：
①将配制好料液加到补料瓶a，用硅胶管c将补料瓶a和补料隔膜阀e（含小排气阀g、卡箍连接件i、j）连接好，关闭隔膜阀e后，整体放入灭菌锅内灭菌；
②将灭菌后的硅胶管c安装到蠕动泵d内，并用卡箍连接件i、j将补料隔膜阀门e、小排气阀g与相应管路连接好；
③打进蒸汽阀h，打开小排气阀g，稍微打开补料隔膜阀f，对补料管路进行灭菌；
④灭菌完毕后关闭进蒸汽阀h和小排气阀g，打开补料隔膜阀e；
⑤打开计算机控制系统上的补料程序，进行自动补料。

优缺点：该方法最大的优点就是可以对整个补料管路进行在线SIP，彻底消除灭菌隐患，满足GMP法规的要求，但是只能应用于试验罐或小规模发酵补料。
注意点：呼吸过滤器的完整性往往被用户忽视，导致染菌而不自知。

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03
大规模生物过程补料
基于流量计的补料
流量计一般选用质量流量计、电磁流量计、涡街流量计等。其中质量流量计适用于电导率低的介质，测量精度可达到±0.25%；电磁流量计适用于电导率高的介质，测量精度达到±0.5%；涡街流量计适用于电导率低的介质，测量精度达到±0.75%，可根据实际情况要求选择相应的流量计。

流量计式补料系统工艺流程见上图，流量计与气动隔膜阀组成一个补料控制回路，流量计检测累计补料量，气动隔膜阀控制流加。控制策略可以分为两种：一种是与pH、DO、浊度等分析仪表进行闭环控制，例如补碱、氨水、消泡剂等；另一种是按时间和数量进行的流加控制，例如补硫胺、糖液等。
补料控制一般采用PID控制，每隔一个扫描周期采样一次，与上次的数值进行对比，通过PID算法将补料量转换为开阀时间。
优缺点：结构简单，功能强大，与计算机配合可实现自动补料工艺。缺点是对不同的补料通用性稍差，易受流量计前后压力波动的影响等，但从长远看这是一种能够替代计量杯补料的系统。
基于计量杯的补料方式
计量杯式补料系统在抗生素发酵生产中应用较广，其原理是把欲补充的营养物质按计量罐的容积，根据补料速率，换算成相应的时间，然后等间隔地流加进发酵罐。

计量杯式补料系统工艺流程见上图，主要由进料隔膜阀、计量罐、高/低液位电极、出料隔膜阀等组成。具体操作流程如下：
①在发酵实罐灭菌时，对计量杯系统进行灭菌，或者在补料前对料液分配系统进行灭菌；
②灭菌完成后，关闭小排气阀h和l，关闭进料气动隔膜阀b、出料气动隔膜阀k，打开进料手动隔膜阀j和压力平衡阀g；
③打开计算机控制系统上的补料程序，开始根据设定自动补料。
该补料方式的优点是计量准确，直观，通用性好。
缺点是：使用高低液位电极原理的计量杯式补料系统仅适用于电导率高的液体，对于补油，需要将这种电极更换成光学传感器；另外，这种方式涉及了大量的阀门管道，因此导致操作复杂，容易形成灭菌死角，且维护不方便，未来很可能被其他补料方式取代。

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04
参考文献
1、百度
2、国家FDA药品认证管理中心《药品GMP指南 原料药部分》
3、陶慧《生物发酵系统工艺设计优化》