新手求助：大肠杆菌发酵工艺摸索

remmoon

如果得到关注，希望能与大家长期讨论
背景：发酵新手，研究生时候没有做过发酵，只是学过相关课程，工作了一年，手上有2-3个基因工程大肠杆菌的发酵放大任务（表达的是酶蛋白），现阶段我们摇瓶实验已经完成，开始做5L发酵罐的摸索，我们计划作高密度发酵，如果不作高密度发酵，也希望优化发酵条件，提高表达的酶活（希望能有2倍以上的提高，不知道是否现实）。计划在6月份完成起码两个菌种5L的发酵条件，然后进行30（50）L放大，年底做到300L放大。
因为实验条件所限制，只有一个发酵罐，两个项目一起摸索，因此对于实验设计更加重要，在以后的时间里，希望得到各位的支持。




实验现象一、本周作了两个批试验，两个菌种（都是大肠杆菌，暂且称为A，B），没有控制溶氧、pH、消泡，没有控制任何因素，只是想得到最原始的数据，实验现象表明：这两个菌种都是在发酵两小时内溶氧跌0，直到发酵完成就是在负值；发酵过程从开始泡沫就很多，但是到了对数生长后期泡沫自动消除；pH都由刚开始的7下降到5.8左右。A菌种酶活与摇瓶相当，生长与酶活曲线也和摇瓶一致；B酶活只有摇瓶的一半，但是由于实验安排，我们没有做摇瓶的B的生长和酶活曲线，因此下一步会安排这部分工作。
现在我的疑问是：
1.  是不是大肠杆菌发酵溶氧都会很低（不作任何控制的条件下）？我们的现象正常吗
2.  泡沫的表现可不可以是对数生长末期的标志？如果加入消泡剂，对大肠的酶活影响会有多大？（因为看到过有的同志加入消泡剂后，不产酶了）


我的计划：由于我对发酵罐不是很了解，所以计划作单因素试验，先学习控制溶氧——偶联转速，以及空气流量，先不补料，但是不知道改变这两个条件，能否把过程中的溶氧控制在20%以上？

对于高密度发酵，在我现有的条件下（最简单的发酵罐，只能检测温度、溶氧、pH，罐压不控制），可以做正交试验吗（人手问题，每周只能做两次发酵）？该怎么设计呢？我最重要的考虑因素是什么？

其实我看了不少这方面的书籍，因此理论方面应该还行，准备阶段其实我的信心很足，但是具体操作起来我感觉思路很乱，希望有经验的前辈给我建议。

qq108436966

我觉得溶氧的问题可以这样来分析:由于你所用的菌种是好氧菌,至于溶氧低的程度这个一是与你的菌种优化有关系;再者就是和你该菌的生存环境有关系;消泡剂的使用确实要注意,对数生长起不能只凭泡沫来确定最终还是要以化验的结果为准.

remmoon

qq108436966，您好,谢谢您的分析

但是我的菌种就是基因工程的大肠杆菌，如果要菌种优化该从什么角度来操作呢？其实现在已经算是菌种定了，这周的这批试验只是想得到原是数据，我也没有料到溶氧会跌到这种程度，是不是大肠杆菌都会这样呢？

remmoon

消泡剂，我们已经计划在购买，下周想先利用手头的豆油试一下

细履平沙

楼主写的这个贴子很有意义，希望以后多来。支持！

sea

我认为生长过于旺盛,不妨从以下几个方面做下调整:1  调整一下培养基的基质浓度,避免营养过于丰富.   2  接种量不要太大  3  调整一下培养条件,适当降温培养

remmoon

sea,你好，
1.现阶段培养基就是最基本的LB培养基，您说，营养会多吗？
2.A菌种的接种量是5%，B菌种的接种量是2%，这都是摇瓶试验摸索的比较的浓度。接入发酵罐后的OD一个是0.145，另一个是0.65，这个浓度高不高？
3.因为从我们的理解：对于300L大罐是不是在培养时改变温度，不是特别好操作阿，国产发酵罐的控制系统也不是特别好，所以从生产的可操作性来说，我们放弃了改变温度的培养。不过因为我们都是研发人员，可能在认识上，有所偏差，所以请问降温培养会有什么好处呢？降低温度，是不是应该在诱导的前期进行啊？我们的菌种产酶都是在诱导后的4-6小时，过了这段时间产酶就降低了

remmoon

其实，从B菌生长来看，我们3个小时菌体OD才达到1.0，我们才诱导的，我感觉生长不是特别旺盛。我现在考虑了一下，可能是泡沫起的太多了，可能才造成溶氧下降的，但是在在培养的第7个小时，泡沫就自己消失了，从图中看来，溶氧也没上去，也不知道为什么

remmoon

引用第4楼细履平沙于2007-03-08 19:31发表的“”:
楼主写的这个贴子很有意义，希望以后多来。支持！

谢谢鼓励，我会继续把我的试验情况，和思路给大家汇报，也希望大家多给我一些意见，谢谢

qq108436966

引用第2楼remmoon于2007-03-08 15:53发表的“”:
qq108436966，您好,谢谢您的分析

但是我的菌种就是基因工程的大肠杆菌，如果要菌种优化该从什么角度来操作呢？其实现在已经算是菌种定了，这周的这批试验只是想得到原是数据，我也没有料到溶氧会跌到这种程度，是不是大肠杆菌都会这样呢？

菌种的优化应该从培养基着手,至于消泡剂的话普通食用油就行了!就是量要控制好,因为量会直接影响你菌种的产物