【转载】蛋白工程联手定向进化开启创造之门

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蛋白工程联手定向进化开启创造之门

自然-方法学》 作者：Nicole Rusk


通过将蛋白工程和定向进化两种方法结合在一起使用，研究者开启了一扇创造之门，在他们自己挑选的蛋白质支架中成功载入了具有多种催化功能的酶类。

生物进化过程具有很强的驱动力，它导致大量现代生物物种的产生。然而，一些科学家认为对它的潜力挖掘得仍不够，韩国先进科学技术研究所的Hak-Sung Kim就是这样的一位。他的兴趣源于蛋白工程；他说：“我想运用蛋白工程技术更详细地理解蛋白质的功能。”这一兴趣进而催生了如下想法：合理设计和定向进化如果能够集合在一起使用，那将是一种理想的方式，来更好地理解进化已经导致了什么发生，或者说甚至超越这一层次，创造出一种具有全新催化功能的蛋白质。

在近期发表在《科学》杂志上的一篇文章中，Kim的研究小组介绍了一种功能成分同步整合与调整的实验方法(SIAFE)。作为对有关原理的例证，他们挑选了金属水解酶家族的两个成员，它们仅仅具有很弱的相关性，有相似的整体结构，但在序列上具有很小的相似性，功能上也不相同；它们分别是：细菌性金属 -内酰胺酶，这种酶可将普通抗生素 -内酰胺环进行裂解，进而促使细菌对这些抗生素产生抗性；人体乙二醛酶II，这种酶可催化S-D-乳糖谷胱甘肽中的硫醇型异构体键的水解过程，这是细胞毒素2-羰基醛向2-羟基羧基酸的转化过程中的关键一步。这些研究者的目标就是通过工程化手段将金属 -内酰胺酶的催化活动纳入到乙二醛酶II的支架中。

在第一步工作中，Kim的研究小组运用合理设计的方法，将那些会对 -内酰胺酶底物的结合行为发生位阻作用的所有序列去除。他们最终获得了一个没有催化功能的惰性支架。接着，他们替换了一些氨基酸以便产生那些他们需要的金属结合位点。这样就只剩下对新功能起关键作用的催化位点需要工程化处理了。在这一步骤中，Kim将定向进化引入到了实验方法之中。他们从金属 -内酰胺酶家族中挑选催化位点序列，然后运用重叠的错误倾向PCR技术将它们融合入乙二醛酶II的支架中；这样以来，研究者就创造出了具有各种突变类型且包含有金属 -内酰胺酶活性位点的乙二醛酶II支架。接着，他们对这些新合成的酶类进行筛选，以便找到那些能将抗抗生素特征转入到埃希氏菌属大肠杆菌中的酶类。为了进一步提高那些阳性克隆的催化能力，Kim对它们进行了多轮定向进化的筛选，依次在每步中都增加选择压力。最终，他们就获得了一个具有人体乙二醛酶II支架和160倍增强型金属 -内酰胺酶活动的工程化酶类。

如果不从实际应用的角度考虑，而仅仅作为一个对概念的例证，这无疑是一个积极的进展；因为，没有人会对那些具有对青霉素和其它普通抗生素产生强抗性的细菌感兴趣。然而，人们在这里所感到兴奋的是，它是一种新的方法，研究者利用它可将一种渴望得到的酶类活动引入到他们所选择的任何蛋白质支架。各种可能性的获得仅仅受限于研究者的想象力，这正如Kim所言：“作为一种可创造大量新的催化方法系列用于执行多样性反应的方法，它可以应用到其它的蛋白质支架。”

相对于提高已知酶类的活动能力而言，一种更能引起人们兴趣的可能性诱惑就是，创造一种全新的物质，一种还没有理由通过进化获得的活动能力。Kim推测说：“我们也许可以设计出一些新型水解酶，利用它们将一些化合物中的C-N或C-S键劈开，这在自然系统中目前还没有被观察到过。”看来，将有一个很好的机会，研究者利用它可以在进化方面作些文章了。

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