求助合适的诱变剂

ygl510

我现在做的是紫外诱变，是有关霉菌的，不过致死率很低，有时候却很高，出发菌株变化很大，但我在用相同的出发菌株找规律的时候现象一样。请问有什么对霉菌有较高致死率且安全的方法吗。

细履平沙

先制备原生质体然后再诱变.或者使用DNA shuffling技术.

mtdzcool

DNA改组——定向进化的技术革命

　　军事医学科学院院刊2000年第24卷第2期

刘国奇　王海涛

　　摘　要　DNA改组(DNA shuffling)是90年代中期发展起来的一种新技术。该文概述了有关DNA改组的基本原理和方法，并跟踪了当今该领域的最新研究成果和发展动态。

　　关键词：DNA改组；定向进化；基因表达；技术革命

　　1994年，一种崭新的定向分子进化新技术——DNA改组(DNA shuffling) ［1］在美国Affymax研究所的Stemmer实验室悄然出现。该技术在试管里模拟达尔文进化的过程，在分子水平上创造分子的多样性（molecular diversity），结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的变异。几年来，它以强大的生命力，在世界各地许多实验室里“生根发芽，开花结果”。DNA改组技术的日臻成熟及推广应用，推动了生物工程的诸多领域突飞猛进地向前发展。作为生物工程的新生长点，DNA改组必将带来一场深刻的技术革命。

　　1　DNA 改组的内涵

　　如果说70年代发展起来的DNA重组技术开辟了基因工程的新天地，那么，90年代的DNA改组技术将开创定向分子进化的新纪元。

　　DNA改组是指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(sexual recombination)。通过改变单个基因(或基因家族， gene family)原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。实际上，该技术是一种分子水平上的定向进化(directed evolution)，因此也称为分子育种(molecular breeding)［2］。在创造新基因的过程中，要设法产生各种变异。这主要通过有性PCR(sexual pCR)［3］、交错延伸程序(stagger extension process， StEP)［4］完成。值得指出的是，DNA改组的效果必须由改组后的基因表达产物的功能来验证。因此，灵敏可靠的选择或筛选方法是DNA改组技术成功与否的关键。

　　2　DNA改组的技术路线及发展

　　1994年，Stemmer等首先发表了第一篇题为“用DNA 改组技术体外快速进化蛋白”的论文，奠定了DNA改组技术的基础，日后的改进及补充使该技术日臻成熟，目前已形成了较为完善的技术路线。

　　在DNA改组技术发明之前，定向诱变和随机诱变方法为基本的创造变异的途径。定向诱变适合于对基因及表达的蛋白产物的三维结构及功能等方面的信息了解得较为透彻的前提下所采用的方法。以往的研究表明，这种方法的成功率并不高。在大多数情况下，对目标基因表达产物的高级结构知之甚少，此时根本无法运用定向突变的方法。

　　随机诱变方法是通过引进随机的碱基替换，进而筛选理想的突变体。通常，采用错误倾向PCR(error-prone pCR)［5］方便地引进突变。本方法的关键点在于如何选择合适的突变频率。一般有益突变的频率很低，绝大多数突变是有害的。当突变频率太高时，几乎无法筛选到有益突变；但突变频率也不能太低，否则未发生任何突变的野生型将占据突变群体的优势，也很难筛选到理想的突变体。以往的研究表明，目标基因内有1.5～5个碱基发生碱基替换时，诱变结果是最理想的［6］。总体来看，随机诱变的方法带有一定的盲目性，在实际工作中成功率很低。

　　最初的DNA改组方法是在随机诱变的基础之上发展而来的。如图1首先对一组序列相关的 dNA序列（经随机诱变得到的一组有益突变体，或天然存在的基因家族），经过超声波处理或用DNA酶I(DNase I)消化产生一系列随机切割的DNA片段，然后，在没有引物的情况下，采用有性PCR方法进行合成。随着循环数的增加， PCR产物将越来越接近切割前的目的基因的长度。最后，用基因两侧的引物合成全长的基因。该基因已经包含了不同突变体发生的突变。在DNA改组中，包括基因重新组装的过程，正是这一点，DNA改组与以往的诱变技术有根本的不同。



图1　有性PCR法改组DNA的基本程序

　　1997年，France Arnold研究组巧妙地设计了PCR程序，将DNA改组技术进一步改进提高。他们创造性地提出了StEP，如图2。在一个反应体系中以两个以上相关的DNA片段为模板，进行PCR反应。引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性和短暂的复性/延伸反应。在每个循环中，延伸的片段在复性时与不同的模板配对。由于模板的改变，所合成的DNA片段中包含了不同模板DNA的信息。这种交错延伸过程继续进行，直到获得全长的基因。由此可以看出，交错延伸程序的核心点也是有性PCR技术。此方法较上述有性PCR法，省去了用DNA酶切割成片段这一步，因而简化了DNA 改组的方法。



图2　交错延伸法改组DNA的基本程序

　　3　DNA 改组的创新性

　　较以往定向进化方法，DNA改组技术具有以下创新之处。

　　首先，DNA改组技术使得进化速度较常规的定向进化大大加快。在自然界中，一种蛋白分子的进化是一个极其漫长的过程，在突变与达尔文选择的动态平衡中缓慢进行，需要经过成千上万年的岁月。DNA改组技术创造性地将这一历史过程缩短到有限的几天。这岂不是生物进化领域的技术革命!美国《新科学家》杂志形象地将DNA改组技术描绘为“有性的革命(sexual revolution)”。由于DNA改组技术能在分子的水平上大量创造和生产优质的分子，因此也称之为分子育种。在优化包括质粒、部分基因组、病毒基因组在内的DNA序列方面表现出简便高效的特点。在某些方面， dNA改组技术像传统的定向进化方法，在进化过程中不必了解具体造成这种改变的中间过程的细节，只需要检测 dNA改组带来的效果。同时，与常规的定向进化程序相比，DNA改组技术有了质的飞跃。表1从不同的角度比较了分子定向进化与常规定向进化的不同［7］。

表1　DNA改组与常规定向进化的比较

项目 进化速度 进化对象 进化

　　周期
影响

　　对象
是否可用

　　微生物手段

常规定向进化 缓慢进化 整个基因组 多年 完整基因组 否
DNA改组 快速进化 特定基因/操

　　纵子/病毒
几天 部分基因组 是

　　由于DNA改组针对某个特定的基因，其优势在于时间短，见效快。自然界中DNA的重组依赖于各种机制，其中DNA链的断裂融合是最常见的途径。DNA改组是通过片段化的 dNA在体外重新组装。经过改组后的DNA可以导入各种模式细胞中，使得遗传操作具有很大的主动性，且改组后的基因表达产物易于识别、鉴定，从而大大提高了优化DNA片段的速度。

　　其次， DNA改组比随机诱变显著地提高了良性突变的概率。美国得克萨斯大学奥斯汀分校的 ellington对随机诱变和DNA改组两种方法进行比较。结果表明，DNA改组技术比随机诱变具有较大的优势，随机诱变的方法一般产生1%的良性突变，但DNA改组技术产生13%的良性突变；后者比前者的成功率高12倍。Stemmer用DNA改组技术将细菌对抗生素的抗性提高了32 000倍，对照的随机诱变方法只能提高16倍。

　　第三，DNA改组技术的方法巧妙，重点突出，着重实效。要从大量的突变体库中获得理想的个体，最首要的问题是筛选方法，筛选方法越好，成功的可能性越大。因此，DNA改组技术把筛选方法放在首位。试想，要从上万个克隆中找到一个理想的个体，没有行之有效的筛选方法，几乎是个梦想。DNA改组技术在巨大的突变体库中，先选择表现出预期功能的相关基因，进一步改组后，进行下一轮筛选改组工作。这样，所建的突变体库小，定向进化效果显著。另外，DNA改组技术从表型上早期进行选择，而不必了解DNA片段上序列上的信息，简化了操作程序。因此，把梦想变为现实。

　　正是由于DNA改组技术的先进性，在分子进化领域捷报频传，给世人一个又一个惊喜。表2列出了部分研究成果。

表2　部分DNA改组技术的研究结果

类　型 示　例 特　性 活性增加倍数 潜在应用领域
蛋白 马心肌球蛋白

　　绿色荧光蛋白

　　重组蛋白RecA
过氧化物酶活性

　　荧光强度

　　重组率
25［8］

　　45［9］

　　100［10］
生物制药

　　基础研究

　　基础研究

抗体 鼠源抗体

　　人源抗体
表达水平

　　亲和性
100［11］

　　400［11］
生物制药

　　生物制药

酶 谷胱甘肽转移酶 底物特异性 100［12］ 生物制药
　 天冬氨酸转氨酶 催化特异性 10 000［13］ 生物制药
　 过氧化物酶 50℃热稳性、 110［14］ 工业酶
　 　 抗氧化性 2.8
　 枯草菌素E 65℃半衰期 25～50［4］ 工业酶
　 β-内酰胺酶 抗生素的抗性 32 000［1］ 抗生素
　 卡那霉素磷酸转移酶 抗生素的抗性 64［7］ 抗生素
　 人碱性转移酶 碱性基团的转移 10［7］ 生物制药
　 β-半乳糖苷酶 底物特异性 1 000［15］ 基础研究
　 头孢菌素酶 特异活性 270～540［16］ 生物制药
　 HSV胸腺嘧啶激酶 磷酸化活性 500［18］ 基因治疗
细胞因子 肿瘤抑制因子P53

　　人类干扰素
37℃半衰期

　　抗病毒
12［18］

　　285 000［2］
基因治疗

　　基因治疗

代谢途径 Antrazine 代谢途径

　　砷酸盐代谢途径

　　汞代谢途径
Antrazine降解

　　砷酸盐解毒

　　汞解毒
80［7］

　　40［19］

　　12［7］
生物制药

　　生物制药

　　生物制药


　　4　DNA 改组研究动态及应用前景　　DNA改组方法最初采用单个基因进行改造。如荧光蛋白基因、β-半乳糖苷酶基因等。采用基因家族进行基因改组（family shuffling）是富有成果的尝试，并逐渐成为DNA改组的主要方法。基因家族里的基因可以来源于不同种、属。但要求被改组的DNA基因之间要有一定程度的同源性。一般DNA序列间要有足够的相似性，以保证信息的交流，即基因间彼此的同源性足以支持有性PCR反应的进行，具体体现在：在有性PCR过程中，在不断地变性／复性反应中能在不同模板上随机互补结合并进一步延伸。例如：在人源与鼠源IL-1β基因之间平均有连续4个碱基的相同，仍然可以成功地进行DNA的改组。

　　研究表明，采用基因家族的改组效果明显高于单个基因的改组效果。Stemmer等对4个来源于不同种的头孢菌素酶基因进行了改组研究。结果表明单个基因改组的效果为改组前的8倍。4个基因同时改组后效果增加了270540倍。因此，在可能的情况下，采用基因家族进行改组，不失为明智之举。

　　DNA改组技术自诞生之日起就显示了其巨大的应用价值，在生物工程的各个领域均具有巨大的应用潜力。

　　在基础理论研究中，报告基因如β-半乳糖苷酶基因、绿色荧光蛋白在研究基因表达和调控中具有非常重要的作用。使用绿色荧光蛋白做报告基因时，在许多真核细胞中由于整个细胞的荧光信号太弱，使实验结果的真假阳性难以分辨。Anreas等运用DNA改组，分别在E.coli和CHO细胞中表达改组后的绿色荧光蛋白，其荧光强度比目前商品化的 clontech公司的荧光蛋白提高了45倍和42倍。进一步研究表明，荧光强度的提高并不是表达量的变化，而是由于新的荧光蛋白分子结构的变化，变为可溶性蛋白，并能激活色素基团。测序结果表明，导致这些变化的分子机制是在基因的第100，154，164位发生了3个氨基酸的变化。

　　DNA改组技术为特种工业酶的研究成功提供了有效的工具。通过DNA改组，提高了工业酶的适应性。不同的工业加工流程中，环境条件与自然条件完全不同，工业酶的催化反应通常处于高温条件或有机溶剂存在的环境、含有去污剂或氧化剂的环境、极端酸碱的环境等。在自然界进行选择时，根本无法筛选到能在上述恶劣条件下完成催化反应的酶。运用常规的蛋白分子设计也难奏效。这一方面是由于对酶分子的结构或功能的了解还很肤浅；另一方面，影响酶发挥功能的因素过于复杂。运用DNA改组技术，在人工模拟的环境下进行选择，已经成功地得到了各种特种功能的工业酶，可满足工业生产的特殊需要［20］。Maxygen公司的科学家从26种微生物中克隆了工业酶基因。运用DNA改组技术，他们创造了600个新的子基因，其中77个可以表达超级酶。通过筛选，发现这些超级酶在高、中、低三种pH的环境下，均比自然存在的酶有较好的功能；其他超级酶具有抗有机溶剂或抗热性，具有巨大的商业价值。

　　在医药研究方面，DNA改组为生物制药、疫苗研制、基因治疗等注入了新的活力，为人类攻克疑难病症提供了希望。目前，超级干扰素可称得上是最成功的研究。α干扰素在病毒和癌症的治疗上具有巨大的市场。运用 dNA改组技术对20个已知的人类干扰素基因进行改造。通过改组，得到了2000个子基因。其中最成功的一个子超级干扰素基因，其表达产物的活性比市场上出售的干扰素α-2b的活性高285000倍。可以预言，超级干扰素的投入市场，必将降低成本，这无疑是肝炎和癌症患者及其家属的福音。

　　此外，DNA改组技术在农业、石油化工、生物治疗、兽药研究、营养、人类基因治疗、生物武器的研究等重要领域也具有广阔的的应用开发前景（表3）。可以看出，DNA改组几乎可以应用到与国计民生相关的各个领域。

表3　DNA改组技术的应用领域

分　类　 用途
进化DNA 转基因；疫苗载体；DNA疫苗；表达载体；基因转移载体
进化蛋白 基因治疗用酶；细胞因子；生长因子；抗体；工业酶
进化生物体 植物；科研用生物体；化学及药物加工；疫苗有机体；石油加工；除污生物

　　前面谈到的DNA改组技术的发明人Stemmer博士，他以5项美国专利为技术支撑点，于1997年创立了专门从事DNA改组研究的公司Maxygen。公司刚刚建立，世界上几家最大的公司纷纷与之洽谈并建立了合作关系。这些公司包括最大的农业公司 duPont公司、生产抗生素的世界巨头 DSM公司和工业酶研究生产之最的Novo nordisk公司。此外，迄今为止，Maxygen公司还得到了来自美国国防高级研究计划局(DARPA)和国家科学技术协会(NIST)的5项资助，共计2100万美元(参见www.maxygen.com)。这也从另一角度反映了DNA改组的重要性及美国政府及商家对DNA改组技术的重视程度。

　　随着该技术的推广应用，越来越多实验室加入DNA改组有关的研究中。据来自1999年7月20日因特网上的信息，在与DNA改组研究有关的实验室中，主要集中在美国,在欧洲国家也分布有少数实验室。在亚洲，只有日本有几家实验室。遗憾的是，截止到本文完稿之时尚未检索到我国与DNA改组技术有关的研究报道，这反映了我国在DNA改组技术方面几乎还是个空白。作者认为，能否抓住机遇，及时赶超，将是我国在生物领域的研究与应用方面，能否在下一世纪占据国际领先地位的关键。因此，从国家的根本利益出发，清醒地认清历史赋予生物科学工作者的使命，创造性地开展DNA改组有关的研究工作，是对党和政府科教兴国战略的积极响应。

　　5　DNA改组的研究需要正确引导和科学管理

　　同以往的任何一次科技进步一样，DNA改组技术将为人类带来巨大的福利，这是不容置疑的。但同时不难看出，DNA改组也可能带来许多问题，对人类命运会产生负面影响。DNA改组在创造服务于人类的超级分子的同时，也使人为地迅速创造物种包括病原物成为可能。因此，需要尽早制定相应的法律法规，以尽早规范研究行为，挖掘DNA改组技术的潜力，极大限度地造福于人类。

　　千百年来，达尔文的进化论早已深入人心。物竞天择、适者生存是达尔文生物进化论的精髓。人工定向进化在人类征服自然、改造自然的伟大实践中实现了一次又一次的飞跃。当今的DNA改组技术以其前所未有的创新性及革命性使人工定向进化如虎添翼，其迅猛发展的势头如排山倒海，锐不可挡。我们有理由相信，借助于DNA改组的威力，科学家们定会在生物工程的各个领域中创造出让世人瞩目的奇迹来。［作者简介］刘国奇(1964-)，男，河北廊坊人，博士。

　　刘国奇(军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京　100071)

　　王海涛(军事医学科学院微生物学流行病学研究所， 北京　100071)

　　参考文献

　　［1］Stemmer WPC.Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling［J］.Nature,1994,370(6488):389.

　　［2］Chang CC,Chen TT,Cox BW，et al.Evolution of a cytokine using DNA family shuffling［J］.Nat Biotechnol，1999,17(8):793.

　　［3］Smith GP.Applied evolution.The progeny of sexual PCR［J］.Nature,1994,370(6488):324.

　　［4］Zhao H,Giver L,Shao Z，et al.Molecular evolution by staggered extension process(StEP) in vitro recombination［J］.Nat Biochnol,1998,16(3):258.

　　［5］Gram H,Marconi L,Barbas CF，et al.In vitro selection and affinity maturation of antibodies from a naive combinatorial immunoglobulin library［J］.Proc natl Acad Sci USA,1992,89(8):3576.

　　［6］Harayama S.Artificial evolution by DNA shuffling［J］.Trends biotechnol,1998,16(2):76.

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　　［16］Crameri A,Raillard SA,Bermudez E，et al.DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution［J］.Nature,1998,391(6664):288.

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　　［19］Crameri A,Dawes G,Rodriguez EJ，et al.Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling［J］.Nat biotechnol,1997,15(5):436.

　　［20］Schmidt-Dannert C,Amold FH.Directed evolution of industrial enzymes［J］.Trends biotechnol,1999,17(4):135.

zhang8292

是不是平板里水很多呀?UV的穿透里很弱,不能液体太多.诱变完后,要用黑纸包住,防止光复活.你可能没注意.

常用方法ES,NTG.都可以.

还有其他方法,当对设备或其他要求太高.可能不好找.

如果菌右边史不长,可以用大计量的诱变机,将致死率控制在95%.