【加密0】【论文】植物细胞培养生物反应器的研究进展

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植物细胞培养生物反应器的研究进展

刘志伟　郭　勇　张　晨

　　摘要　介绍了用于植物细胞培养的搅拌式反应器、非搅拌式反应器、光反应器及固定化反应器等，为植物细胞培养中反应器的选择和设计提供参考。
　　关键词　植物细胞培养，生物反应器

Research progressin bioreactor for plant cell culture

Liu Zhiwei, Guo Yong
(College of Food Engineeringand Biotechnology,South China University of Technology, Guangzhou 510640)
Zhang Chen
(Department of Biology,Jiaying University, Meizhou 514015)

　　Abstract　An introduction to the applications of stir bioreactor ,non-stirbioreactor,photobioreactor,immobilization bioreactor,etc.in plant cel l culture are given.And a reference to selecting anddesigning bioreactors feasi ble for plant cell culture are made.
　　Key words　plant cellculture,bioreactor

　　与天然栽培法相比，利用植物细胞培养技术生产医药、食品、化妆品等具有明显的优点，但植物细胞培养研究中能成功地把摇瓶实验的结果在生物反应器中再现的较少，可见研究合适的反应器对于植物细胞大规模培养生产次级代谢产物是非常重要的。
　　植物细胞培养反应器最初大多采用微生物反应器。由于植物细胞与微生物细胞形态结构不同，植物细胞较微生物细胞大，对剪切力耐受性差，而且对氧的要求相对微生物要低得多，因此微生物反应器并不完全适合于植物细胞生长与生产。目前，出现了许多有别于传统微生物反应器的植物细胞培养反应器并在不断完善。用于植物细胞培养的反应器主要有搅拌式、非搅拌式及其改进型反应器，另外还有植物细胞固定化反应器和膜反应器等。

1　机械搅拌式生物反应器
　　机械搅拌式生物反应器有较大的操作范围，混合程度高，适应性广，在大规模生产中广泛使 用。
　　搅拌罐中产生的剪切力大，容易损伤细胞，直接影响细胞的生长和代谢，特别对于次级产物生成影响极大。搅拌转速越高，产生剪切力越大，对植物细胞伤害越大。对于有些对剪切力敏感的细胞，传统的机械搅拌罐不适用。为此，对搅拌罐进行了改进，包括改变搅拌形式、叶轮结构与类型、空气分布器等，力求减少产生的剪切力，同时满足供氧与混合的要求。
　　Kaman等采用带有1个双螺旋带状叶轮(helical ribbon impeller)和3个表面挡板的搅拌罐，证明适于剪切力敏感的高密度细胞培养［1］。Jolicoeur等进行了类似的研究，在反应器中得到与摇瓶相同的高浓度生物量［2］。钟建江等通过培养紫苏细胞进行比较，发现带以微孔金属丝网作为空气分布器的三叶螺旋桨反应器(MRP)能提供较小的剪切力和良好的供氧及混合状态，优于六平叶涡轮桨反应器，并认为在高浓度细胞培养时，MRP型反 应器将显示更大的优越性［3］。离心式叶轮反应器(centrifugal impeller bioreactor)与细胞升 式反应器(cell-liftbioreactor)相比具有较高升液能力，较低剪切力，较短混合时间，在高浓度下具有高得多的溶解氧系数，表明有用于剪切力敏感的生物系统的巨大潜力［4］。另有方框型桨式搅拌、蝶型涡轮搅拌等不同形式的机械搅拌罐用于植物细胞培养的生产和研究，结果证明不同叶轮产生剪切力大小顺序为涡轮状叶轮＞平叶轮＞螺旋状叶轮［5］。一种升流式生物反应器(lift-stream bioreactor)利用罐中心一根连有多孔板的杆上下移动达到搅拌的目的，可用于培养剪切力敏感细胞［6］。

2　非搅拌式生物反应器
　　相对于传统搅拌式反应器，非搅拌式反应器所产生的剪切力较小，结构简单，因此被认为适合植物细胞培养，其主要类型有鼓泡式反应器、气升式反应器和转鼓式反应器等。
　　通过对培养紫苏细胞的生物反应器比较发现鼓泡式反应器优于机械搅拌式反应器［3］。但由于鼓泡式反应器对氧的利用率较低，如果用较大通气量，则产生的剪切力会损伤细胞。研究表明，喷大气泡时，湍流剪切力是抑制细胞生长和损害细胞的重要原因。较大气泡或较高气速导致较高剪切力，从而对植物细胞有害［7］。
　　气升式反应器广泛应用于植物细胞培养的研究和生产。通过胡萝卜细胞培养研究发现，比较搅拌罐、气体喷射罐和带通气管的气升式反应器，最高细胞浓度和最短倍增时间可从气升罐中得到［8］。气升式反应器用于多种植物细胞悬浮培养或固定化细胞培养，但其操作弹性较小，低气速时，尤其H/D大，高密度培养时，混合性能欠佳。过量供气，过高的氧浓度反而会影响细胞的生长和次生代谢产物的合成。将气升式发酵罐与慢速搅拌结合使用可弥补低气速时混合性差的弱点，采用分段的气升管，也有利于氧的利用与混合［9 ］。
　　转鼓式反应器用于烟草细胞悬浮培养的研究发现，与有一个通风管的气升式反应器相比，相同条件下转鼓式反应器中生长速率高，其氧的传递及剪切力对细胞的伤害水平方面均优于气升式反应器［10］。

3　光生物反应器
　　许多植物细胞培养过程中需要光照，往往考虑在普通反应器基础上增加光照系统，但在实际中存在很多问题，如光源的安装、保护，光的传递，还有光照系统对反应器供气、混合的影响等。小规模实验往往采用外部光照，反应器表面有透明的照明区，光源固定在反应器外部周围［11］。但大规模生产时透光窗的设置，内部培养物对光的均匀接受等问题难以解决，因此许多人对采用内部光源的反应器进行了研究。
　　Mori等发明的反应器将多个透明圆柱体平行安装在反应器罐内，光源放置在透明圆柱体中，供给CO2的气体交换器在罐内两个圆柱之间［12］。Ogbonna等研制了一种用于大规模培养光合细胞的新型内部光照搅拌式光生物反应器，它由每个单元都包含光源的多个单元组成。大的光生物反应器通过增加单元数目得到。每个单元中心固定一个玻璃管，光源插入其中，由搅拌桨实现混合，该搅拌浆设计成旋转时不接触玻璃管，玻璃管同时作为挡板，该反应器在低转速下仍有较高混合程度，而且剪切力较小。由于发光体并非机械固定在反应器上，且通过玻璃管与发酵液分离，因此反应器可高压灭菌，而发光体在冷却后插入玻璃管［13］。Yamamurak等研究固定CO2的光反应器，特别之处在于搅拌器具有发光作用［14］。

4　其他新型生物反应器
　　根据植物细胞的特性，许多有别于传统微生物反应器的新型反应器正用于植物细胞的研究生产，如各种固定化植物细胞反应器和膜反应器等。
　　Dubuis等用新型环回式流化床反应器(loop fluidized bedreactor)进行coffea arabica培养，测定了生长和产物合成的动力学参数，认为该反应器操作方便，消除了气体直接喷射引起的剪切力，易于测定放大所需的参数，适合中试和工业化生产［15］。Nagai等用固定床反应器培养固定化烟草细胞，生长速率与摇瓶相同，胞内合成与摇瓶无明显区别 ［16］。
　　Tyler等报道了一种植物细胞表面固定化培养系统，避免了传统搅拌罐悬浮培养中的流体流动力或剪切力问题，并促进植物细胞凝聚的特性，使次级代谢产物合成和积累增加，而且该系统培养基交换简单，次级产物提取容易［17］。Lang也研究了植物细胞膜反应器，将细胞固定在膜上3 mm厚一层，培养基在膜下封闭回路循环流动，营养透过膜扩散至细胞层，次级代谢物分泌透过膜扩散至培养基［18］。
　　Humphrey对植物细胞培养微孔膜通气反应器进行了研究，分析了氧传递，为需要小剪切力的植物细胞培养的膜通气反应器提供设计依据，设计应考虑的因素包括管的长度、直径和膜厚度，进气的组成和压力，细胞生长培养阶段等。

5　展望
　　许多实验证明，在植物细胞培养过程中，抑制细胞生长和损伤细胞的主要是剪切力，而不是氧供应不足，相反，过高的氧浓度往往抑制细胞生长和产物合成。提高混合程度，减低剪切力，是目前设计适于植物细胞培养反应器的主要原则，但如果能提高植物细胞对剪切力的耐受程度，将大大简化反应器的选择和设计问题。很多情况下，剪切力抑制产物的合成，但对生长影响不大，探讨其机理有助于采取相应措施解决。对于需要光照的细胞，还要考虑光源的设置、光传递及光的产热问题。
　　不同植物细胞的特性，如对剪切力的耐受性、结团情况、倍增时间、对氧和光的需求等各不相同，没有哪种反应器能满足所有植物细胞的要求，实验中应根据细胞特性采用合适的反应器，进一步研究各种植物细胞和不同反应器中流体力学的性质，可为选择和设计植物细胞培养反应器提供可靠的依据。