基因工程菌固定化研究进展

细履平沙

基因工程菌固定化研究进展

孙　进　吴梧桐

　　

　　固定化细胞的研究和应用始于本世纪70年代,随后得到了快速发展,这是由于其具有以下优点1).可以连续使用或重复使用。(2).在连续操作的培养过程中,可以采用高稀释率而不会将细胞洗出。(3).在生物反应器中维持高细胞密度,从而提高产物的生产能力。(4).连续地从反应器中移去有毒代谢物或具有抑制作用的产物。(5).可以简化产物的提取和纯化工作［1,2］。
　　基因工程提供了经过改进的微生物，在利用这些微生物的时候,人们自然地考虑到使用具有很多优势的固定化技术，事实上正是基因工程菌的固定化研究推动了固定化技术的发展［1］。本文根据固定化后工程菌是否具有生命力，分固定化生长细胞和固定化非生长细胞两部分综述了这方面的研究。

1　固定化生长细胞
　　在长时间的培养过程中,利用重组菌的生物反应器的生产率极大地受到质粒不稳定性的影响。通常将质粒不稳定性分为两类:一类是结构不稳定性,也就是质粒由于碱基突变、缺失、插入等引起的遗传信息变化;另一类是分离不稳定性,指在细胞分裂过程中质粒不能分配到子代细胞中,从而使部分子代细胞不带质粒(即P-细胞)。在连续和分批培养过程中均能观察到此两类现象发生。一般情况下具有质粒的细胞(即P＋细胞)需要合成较多的DNA、RNA和蛋白质,因此其比生长速率低于P-细胞,从而P-细胞一旦形成能较快速地生长繁殖并占据培养物中的大多数。影响质粒维持的因素有以下几个:质粒自身的特征(大小、拷贝数、基因表达水平、基因表达产物等);宿主的基因型和培养条件(温度、搅拌、稀释率等)［2］。
　　提高重组菌稳定性的方法有以下两种:一是控制培养条件,如在培养基中加入选择压力来抑制P-细胞的生长,常用的选择压力有添加抗生素、通过质粒进行营养缺陷型互补等,但是这些培养基在工业上的制备较为不易甚至是被禁止的［2］，另外可在两级连续培养中的各级采用不同的培养条件,如在第一级中培养重组菌,在第二级中使其表达产物.二是采用遗传学方法,如采用营养缺陷型突变株;在质粒中插入分配位点,以克服分离不稳定性;使用重组缺陷宿主;调节基因表达等［2,3］。
　　除以上方法外,固定化也能有效地提高基因工程菌的稳定性,详见表1。

Tab 1　Immobilization of Genetically Engineered Bacteria


菌　　株 质粒 克隆基因产物 固定化基质 参考文献
B.subtilis 273 pPCB6 胰岛素原 琼脂糖 4
E. coli B pTG201 儿茶酚2,3-二氧化酶 k-卡拉胶 5
E. coli BZ18 pTG201 儿茶酚2,3-二氧化酶 k-卡拉胶 6,24
E. coli C600 pBR322 β-内酰胺酶 中空纤维膜 7
E. coli HB101 pHI301 α-淀粉酶 k-卡拉胶 8
E.coli HB101,B,W3101 pTG201 儿茶酚2,3-二氧化酶 k-卡拉胶 9
E. coli JM105 pKK223-200 D-木糖酶 k-卡拉胶 10
E. coli W3101 pTG201 儿茶酚2,3-二氧化酶 k-卡拉胶 11
E. coli W3101 pBR322 β-内酰胺酶 k-卡拉胶 12
E. coli W3110 pBR223-200 β-内酰胺酶 海藻酸钙 13
E. coli WA802 pBR322 β-内酰胺酶 棉布 14
E. coli W3110 pTG205 儿茶酚2,3-二氧化酶 k-卡拉胶 15,16
S.cerevisiae C468 pGAC9 葡糖淀粉酶 棉布 17
S.cerevisiae pSH206 绒毛膜促性腺激素 k-卡拉胶 18
S.cerevisiae DYB745 pSH206 pSH096 β-半乳糖甘酶 超滤膜和反渗透膜 19
S.cerevisiae Mc16 pMA230 α-淀粉酶 明胶 20


1.1　固定化对稳定性的影响
　　当使用重组菌进行培养时，质粒能否在宿主中保持遗传稳定性是至关重要的问题。在大规模培养时需要大量重组菌作为种子，利用游离培养制备的种子中会含有较多的P-细胞，极大地影响随后的扩大培养，而用固定化细胞制备种子可以解决这一问题［3］。对pTG201质粒，分别采用E.coliHB101,E.coliW3101和E.coliB作为宿主所得的重组菌在游离培养中稳定性差异很大；而经过固定化，三者在经过200代到300代培养后都无明显的质粒不稳定性［9］。重组的E.coliJM105固定化后，连续培养500代仍能保持较好的稳定性［10］。固定化的E.coliW3101在高于最大比生长速率下进行单级连续培养，120代后带质粒的细胞仍能维持100％；而游离细胞的连续培养，在90代后不管稀释率如何，具质粒的细胞均有很大程度下降［9］。培养E.coliB(pTG201)的研究发现：游离细胞培养80h后60％的细胞不具质粒；而固定化细胞培养200h后只有5％的细胞无质粒［14］。采用游离细胞的两级连续培养，使两级条件分别适合生长和表达，虽较单级连续培养有较大优势，但仍然由于第一级中质粒的不稳定性而使得整个系统不能进行长期培养。当在第一级中采用固定化重组菌，则在两级中均能维持较长时间的质粒稳定性，并且目的基因产物的活力较高［15］。采用超滤膜和反渗透膜将重组酵母固定化，其稳定性较摇瓶有所提高［19］。
1.2　固定化提高基因工程菌稳定性的原因
　　游离细胞培养过程中出现的质粒高度不稳定性可能是由于如下原因：质粒的高拷贝数对细胞是有害的，并因此使具质粒细胞在与不具质粒细胞的竞争中处于劣势［2］。而固定化颗粒的物理性能，使得两种细胞间的竞争被极大地降低。固定化基质中的微小区室使细胞经过有限次的分裂形成小克隆，Nasri等人发现无论接种量如何这些小克隆在释放到培养液中去之前只能繁殖10～16代［8］，在此过程中即使出现P-细胞，也会由于延迟期的存在使其无法与P＋细胞竞争而占据培养物中的大多数［2.8.10.21］。例如将具有pTG201和不具pTG201的E.coliB混合，游离培养后发现P＋细胞很快消失，而共固定化后的培养则P＋细胞和P-细胞能维持恒定比例达80代以上［9］。随着凝胶颗粒中细胞的生长，凝胶的刚性极大地降低，靠近凝胶颗粒表面的微孔破裂并将其中的细胞释放出来［22］。因此固定化生长细胞可被看成是一个免受P-细胞竞争的细胞库［2，8，22］。除了限制细胞分裂次数外，质粒拷贝数的增加也使得质粒的稳定性提高［12］，Sayadi等的实验表明：E.coliW3101(pTG201)固定化培养物中质粒拷贝数一直稳定在250左右［11］。电镜照片显示固定化细胞间存在紧密接触，似乎有可能由于质粒的转移而提高了工程菌的稳定性，通过将E.coliW3101Nalr和E.coliW3101Apr细胞共固定化并培养后发现：没有细胞能在含有萘啶酮酸和氨苄青霉素的平板上生长，从而否定了固定化通过质粒转移提高质粒稳定性的可能［9］。因此，固定化培养细胞中质粒拷贝数的增加和凝胶中有限的细胞分裂次数是提高质粒稳定性的基本因素。
1.3　固定化生长细胞的生物量生产
　　在多糖凝胶珠中，即使接种量不同，细胞都生长成球形小菌落，在凝胶的截面上形成三个区域：(1).好氧性细胞生长区，此区内营养成分(如葡萄糖)和氧均维持一定的浓度，其厚度为凝胶的10％，此区细胞浓度可达1010～1012个/mL胶，在凝胶表面形成一致密层；(2).缺氧性细胞生长区，此区内营养成分虽维持一定浓度但氧浓度为零，细胞浓度约为109个/ml胶；（3）.非生长区域，此区内营养成分和氧浓度均为零，没有细胞的生长［2］。这三个区域的形成是由于颗粒内存在物质的扩散阻力。利用中空纤维膜反应器培养固定化的E.coliC600(pBR322)获得了较高的细胞密度［7］。影响生物量的因素有接种量、凝胶体积、胶浓度等，通过调节这三个因素可以增加固定化细胞反应器中的细胞浓度而增加总的生产率。研究结果表明：增加反应器中的凝胶体积可提高反应器的生物量；当接种量较小时，则凝胶珠中心有少量细胞生长；接种量大时，凝胶中的细胞浓度高，并且连续反应器出料中细胞浓度也高［16］。固定化细胞的培养液中细胞浓度较游离培养的为低，但以凝胶体积计则生物量提高两倍［22］。Texis等发现游离细胞和固定化细胞连续培养虽然总细胞量相近，但100代时间内固定化培养的P＋细胞分率明显高于游离培养［23］。
1.4　克隆基因产物的表达
　　Dhustler等将E.coliBZ18(pTG201)固定化后培养发现由于固定化细胞的高浓度而使酶活力有较大提高［6］。利用中空纤维膜固定E.coliC600(pBR322),因为细胞密度达到1012个/mL空体积，单位体积β-内酰胺酶的生产率为摇瓶中的100倍［7］。固定化重组大肠杆菌的β-内酰胺酶的生产能力较游离细胞高，克隆基因产物的生产率在10～100d内提高了100～1000倍［13］。即使更换受体菌和改变培养条件，固定化重组菌培养的生产率仍比游离细胞培养为高［12］。如果采用高接种量、高凝胶珠体积、低胶浓度和降低凝胶珠直径，则可提高生物量和目的基因产物的生产率［15］。将重组菌固定化后采用两级连续培养，在第一级中培养固定化细胞，在第二级中控制条件使重组菌表达，在D=1.31h-1时稳定操作100h,反应器的生产率为530U/L.h,而采用游离细胞当D=0.2h-1时的生产率仅为34U/L.h［16］。采用气升式发酵罐培养固定化重组酵母的葡糖淀粉酶生产能力和操作稳定性均有很大提高：固定化酵母可稳定生产80代，而游离细胞培养则只能维持10代较低酶活力的生产［17］。利用戊二醛将重组酵母与明胶表面交联进行固定化，可获得最高的产物比生成速率［20］。
1.5　培养条件对固定化工程菌培养的影响
　　在培养基中加入抑制DNA合成的物质(如新生霉素、萘啶酮酸等)可提高目的基因产物的生产，如在单级连续培养中，加入这些物质可在80h内高浓度生产胰岛素原，而同样条件下的分批培养只能维持10h［4］。在无氧条件下培养E.coliB(pTG201),最终凝胶内生物量的分布与有氧培养相似，但生物量减少至109个/ml胶，经过100h培养培养液中仍有90％的具质粒细胞［2］。在通氧的培养过程中，利用微型氧电极测定卡拉胶珠中的氧分布发现：培养20h至30h后，氧可以深入到凝胶珠的80～100μm范围内；在高的液相氧浓度下，细胞的生长速率和目的产物的生产加快，但低生长速率和低产物表达有利于提高基因工程菌的稳定性［5］。即使在葡萄糖、氮和磷限制的培养基中培养，工程菌固定化后稳定性仍能得到提高；但在Mg2＋缺乏的过程中，pTG201表现出相对的不稳定性，并且活细胞数量也减少［9］。重组菌的稳定性受到接种量的影响，接种量小则凝胶内部也会有细胞生长，但同时由于繁殖代数增多，培养过程中质粒的不稳定性升高［10］。重组菌的固定化载体大多采用卡拉胶，Berry的研究表明，卡拉胶的浓度介于1～3％时对出口物料中的细胞数影响不大［2］，但很多研究都采用2％的卡拉胶［8-12,15,18］。其它的固定化载体有硅氧烷、海藻酸钙、琼脂糖、棉布等。
2　固定化非生长基因工程菌
　　全细胞固定化虽较固定化酶具有很多优点，但也有蛋白质或其它细胞成分易渗漏到转化液中和比活力低等缺点。克服这些缺点可采用基因工程菌和合适的固定化技术［24］。比较采用聚丙烯酰胺、卡拉胶、明胶固定化重组CTB2的结果发现：聚丙烯酰胺包埋的回收率高、半衰期长［25］，由于聚丙烯酰胺有毒性，采用聚乙烯醇固定并用硼酸处理，有利于防止菌体渗漏，提高其稳定性［26］，而用卡拉胶固定CTB2，苯丙酮酸的转化率为20％［27］。采用反冲模式操作固定化细胞膜反应器生产6-APA产品质量收率可达90.1％，50批操作后酶活力仍能维持80％［28］。Brunke等人采用固定化P.putidaKT2442:Tn501,能截留近100％的二价汞，连续操作100d流出液中的汞浓度一直低于50μg/mL，比较陶瓷、多孔玻璃和海藻酸钙作载体的结果发现：陶瓷和多孔玻璃的固定化的效果较好，而海藻酸钙的化学稳定性差［29］。用琼脂糖固定E.coliJM101(pPA102),再用戊二醛交联细胞发现：固定化颗粒越大，则有效系数越低；细胞浓度越高，比活越高，有效系数越低［30］。