【加密0】【资料】基因工程菌的发酵

细履平沙

基因工程菌的发酵培养与控制
1 基因工程菌发酵培养基组成与控制        基因工程菌生长培养基成分包括碳源、氮源、无机盐、生长因子和选择剂等5种营养要素，以下分析与宿主菌的主要区别。
1.1 碳源        基因工程菌可利用的碳源与宿主菌相似，包括糖类、有机酸、脂类和蛋白质类。大肠杆菌能利用蛋白胨、酵母粉等蛋白质的降解物作为碳源，酵母只能利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质。在大肠杆菌等以蛋白胨为碳源的基因工程菌发酵中，添加低浓度的单糖如葡萄糖、果糖、半乳糖和双糖如蔗糖、乳糖、麦芽糖及其他有机物如甘油等对菌体生长具有一定的促进作用。低浓度葡萄糖的添加可以有效提高菌体的生长速率，但浓度稍高后就表现出底物抑制作用。另外葡萄糖优先利用会造成培养基的酸化，在发酵控制中是一个值得注意的问题。
1.2 氮源与无机盐        氮源为包括氨基酸和蛋白质、核苷和核酸及其他含氮物质。基因工程菌可直接很好地吸收利用铵盐等，一般不能利用硝态氮。几乎都能利用有机氮源。不同工程菌对氮源利用能力差异很大，具有很高的选择性。有机氮源的利用程度与细胞是否产生分泌相应的降解酶有关。如果能分泌蛋白酶将蛋白胨等降解，就能吸收利用有机氮源。大肠杆菌、酵母等能利用大分子有机氮源，常用蛋白胨、酵母粉等作为培养基的成分。        无机盐包括磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、铜、锌、锰、钼等微量元素的盐离子形态，为基因工程菌生长提供必需的矿物质。
1.3 选择剂、诱导物        基因工程菌往往是具有营养缺陷或携带选择性标记基因，这些特性保证了基因工程菌的纯正性和质粒的稳定性。选择标记有两类，营养缺陷互补标记和抗生素抗性选择标记。基因工程大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、真菌含有抗生素抗性基因，常用卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、博来霉素等抗生素作为选择剂（selective agent），基因工程酵母菌常用氨基酸营养缺陷型，如亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸等，因此在培养基必需添加相应的成分。       对于诱导表达型的基因工程菌，在细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物(inducer)，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。使用Lac启动子的表达系统，在基因表达阶段需要异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，一般使用浓度为0.1～2.0 mmol/L。对于甲基营养型酵母，需要加入甲醇进行诱导。因此诱导物成为产物表达必不可少的。        复合培养基营养较丰富，质粒稳定性一般高于合成培养基。合成培养基中基因工程菌和宿主菌的比生长速率有差异，在复合培养基中，还存在质粒丢失概率的差异。培养基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利于提高质粒稳定性。限制性基质对基因工程菌的比生长速率有不同影响。一般而言，大肠杆菌对葡萄糖和磷酸盐限制易发生质粒不稳定，有一些质粒对氮源、钾、硫等表现不稳定。对于酵母，极限培养基比丰富培养基更有利于维持质粒稳定性。2 基因工程菌发酵环境条件与控制        基因工程菌的生长离不开环境条件，生长发育的进程是营养要素和环境条件的综合结果。环境作为外部因素，对生长具有重要作用，往往可以改变生长状态、代谢过程及其强度。通过稳定生长期的环境因素保证营养生长适度进行，然后调节环境条件如降低或升高温度，保证产物的最大合成和释放。
2.1 温度        不同微生物对温度点和范围的需求是不同的，大肠杆菌和酿酒酵母生长的最低温度为10℃，大肠杆菌生长的最适温度为37℃，最高温度为45℃。酿酒酵母生长的最适温度为30℃，最高温度为40℃。        基因工程菌生长的最适温度往往与发酵温度不一致，这是因为发酵过程中，不仅要考虑生长速率，还有考虑发酵速率、产物生成速率等因素。      外源蛋白质表达时，在较高温度下表达包涵体的菌种，常常在较低温度下有利于表达可溶性蛋白质。对于温度诱导的大肠杆菌表达系统，在生长期为维持37℃，在产物生产期要提高温度，一般为42℃，启动外源基因转录、翻译等过程，实现产物的最大限度表达。对于热敏感的蛋白质，生产期可采用先高温诱导，然后降低温度，进行变温表达，避免蛋白质不稳定性降解。       对于大多数的基因工程菌，在一定的温度范围内，随着温度升高，质粒的稳定性在下降。对于大肠杆菌往往在30℃左右质粒稳定性最好。对于采用温敏启动子控制的质粒，大肠杆菌由30℃升高到42℃诱导外源基因表达目标产物时，经常伴随质粒的丢失。为此，可以建立基于温度变化的分步连续培养，在第一个反应器中，30℃下进行生长培养，增加质粒稳定性，然后流入第二个反应器中，在42℃下进行诱导产物表达。可见温度的控制相当重要，必须选择适当的诱导时期和适宜的诱导温度。
2.2 溶解氧   基因工程菌都是好氧微生物，细胞内的其他一些反应也需要氧参与。无氧呼吸会导致大量的能量消耗，同时产生有机酸，对细胞生长极为不利，甚至有毒害。因此，发酵过程中保证充分的供氧显得十分重要。      当溶氧强度在非选择性培养基中周期变化时，连续培养酵母的质粒稳定性强烈依赖于生长速率，在较低生长速率下完全稳定。提高氧压力或增加氧浓度能引起细胞内氧化性胁迫，而过渡或稳定阶段缺氧条件使产物生成和质粒稳定性受限制。通入纯氧，可增加质粒稳定性，可能是由于菌体生长速率下降所致。搅拌速率能影响细胞生长和产物合成，搅拌强度明显影响质粒丢失速率，质粒稳定性都随搅拌强度提高而下降，温和的搅拌速率有利于保持质粒的稳定性。在搅拌罐发酵时，质粒拷贝数通常较低于摇瓶培养。搅拌罐中通气较好，生长速率较高，有利于质粒的复制。低溶解氧环境中，质粒稳定性差，可能是氧限制了能量的供应。
2.3 pH值        pH值对基因工程菌的生长有重要影响。环境的pH直接影响细胞膜和营养物质的电荷状态，也影响胞外酶的活性，从而改变细胞对营养物质的吸收和转运，进而影响细胞的生长。不同生物的最适pH是不同的，细菌喜欢偏碱性环境，如大肠杆菌适宜pH为6.5～7.5。酵母的适宜pH为5.0～6.0，pH高于10.0和低于3.0不能生长。基因工程菌发酵培养过程常常产酸，使环境pH不断下降，所以生产中要采用有效措施控制pH的变化。        与常规微生物发酵相似，基因工程菌的生长和生产期的pH值往往不同，基因工程菌的生长和质粒稳定性的最适pH值也不一致。了解发酵过程中各个阶段的适宜pH以后，需要进一步设法控制pH在合适的范围内。
3 发酵终点控制
3.1 启动子类型       在质粒载体的基础上，在多克隆位点处插入外源基因所构成表达载体。外源基因表达盒由启动子、目标功能基因和终止子组成。使用在上游或下游有运载蛋白基因、信号蛋白基因、标签寡肽等的载体，与目标基因融合，构成融合载体，有利于增加溶解性和防止产物的降解、定向分泌和亲和纯化。启动子是最关键的元件，它决定着表达的类型和产量。对于大肠杆菌为宿主菌时，最常见的启动子是由lac、tac、T7启动子、PL、PR启动子等。
3.2 产物的表达方式        基因工程菌生产一般是诱导性表达产物，要根据目标基因产物的表达模式而定。对于lac、tac、T7等化学诱导型启动子，PL、PR、等温度诱导型启动子，掌握适宜的时间进行诱导是非常重要的。通常采用两段培养发酵，一般在菌体生长的对数期或稍后一些，进行添加诱导物或升高温度，诱导目标基因开始转录，翻译合成产物。诱导物的浓度及其发酵温度会影响产物的表达量，甚至是产物的存在形式，在生产中应严格控制。对于高表达的包涵体蛋白质，适当降低温度，对包涵体的形成可能起改善作用。对于容易被降解的蛋白质产物，表达阶段降低温度也是有益的和值得使用的。

guo

这么好的东西怎么没人留言呢!谢谢楼主!

yxp1717

刚刚看到，介绍的比较详细，值得一读

liufeihy

thankyou

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