[资料补充]进化、生物性能、崭新的发酵方式

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崭新发酵方式的工艺分析1

崭新发酵方式的工艺分析1——此发酵的培养基配制分析及其注意点
  崭新发酵方式是：选用一新种的植物内生丝状真菌为菌种，以新鲜植物的花、果、种子、茎、叶等为基质，加入蒸馏水，在发酵罐中进行缺氧液态发酵。
  首先介绍配制工业发酵培养基的一般要求：
（1）营养物质的组成比较丰富，浓度恰当，能满足菌种发芽和生长繁殖成大量的有生理功能的菌丝体之需要，更重要的是能显示出产物合成的潜力；
（2）在一定条件下，所采用的各种原材料彼此之间不能产生化学反应，理化性质相对稳定；
（3）粘度适中，具有适当的渗透压；
（4）要考虑所选用的原材料的品种和浓度与代谢产物生物合成过程中的调节关系。要利于主要产物的生物合成并能维持较长时间的最高生产速率，不需要的产物的合成速率降至最低；
（5）生产过程中，即不影响通气与搅拌的效果，不影响或稍影响产物的分离精制和废物处理；
（6）大生产中选用的原材料尽量做到因地制宜，质优价廉，成本低。
  其次，培养基条件与微生物生理学和形态学的相关性：
   培养基条件是指培养基组成、PH值、二价阳离子、阴离子聚合物、表面活性剂和固形物含量等。这些因素对微生物的生理学和形态学有较大的影响，微生物合成次级代谢产物的能力与培养基的条件密切相关。另外，培养基的组成可改善细胞的通透性。
  再次，在该微生物的发酵中，只有种子扩大培养，需要种子培养基；在主要发酵过程中是以新鲜植物的花、果、种子、茎、叶等为基质的，不需要发酵培养基。
   种子培养基是供孢子发芽和菌体生长繁殖用的。营养成分应是易被菌体吸收利用的，同时要比较丰富与完整，其中氮源和维生素的含量应略高些，但总浓度以略稀薄为宜，以便菌体的生长繁殖。发酵中种子质量对发酵水平的影响很大，因此种子培养基能使菌体快速的和大量繁殖菌丝，并使菌丝粗壮，各种有关的初级代谢酶的活力提高。
  下面论述该发酵方式中具体培养基组分的选择及其注意点：
（1）种子培养基应选择能被快速利用的碳源和氮源，碳源选择葡萄糖，氮源选择铵盐，成分单一，质量稳定，铵盐中的氮（三价的）与细胞中有机氮化合物中的氮处于相同的氧化水平，可被菌体直接吸收利用；
（2）无机盐和微元素：
  磷元素可选用磷酸盐；铁元素可省略；钾、锌、镁、钴可选用无机盐和 微生素；钠、钙可省略；水可选用深井水；生长因子可选用少量原宿主植物提取液；前体可省略；
（3）培养基中碳氮比的要求：
  培养基中碳氮比对微生物生长繁殖和产物合成的影响极为明显。另外，碳氮比不当还会影响菌体按比例地吸收营养物质，直接影响菌体的生长和产物的形成。一般情况下，碳氮比约为100：0.2~2.0。
（4）在配制培养基时，应考虑PH缓冲剂的加入和搭配。从某种角度可以说是，铵盐与磷酸盐的加入和搭配；
（5）培养基成分的浓度：
  其浓度与发酵单位、发酵液粘度和溶解氧有密切关系。在该发酵方式中，我们选择“稀配方”，因为它即能降低成本，灭菌容易，氧传递不是重点要考虑的因素。如果营养成分缺乏，在主发酵阶段，菌种能迅速侵染基质细胞，吸收所需要的营养物质，这正是该发酵方式所需要的。
  总之，具体情况，具体分析。不同的微生物所需要的培养基成分不同，不同的发酵生产所需要原材料也不同。要确定一个适合工业规模生产的发酵培养基，并不是一件简单的事情。首先必需先做一些调查研究工作，要了解生产菌的来源、生活习性，生理生化特性和一般的营养要求，其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，一般提取方法和产品质量要求等也需要有所了解，以便在选择培养基时做到心中有数。
  虽然目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验培养基配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用卡氏瓶、玻璃罐等小型发酵设备，对碳源、氮源、无机盐和前体等进行逐一单因子试验，观察这些因子对菌体生长和产物合成量的影响，得到一个比较适合该菌种的生产配方，以求得到高产。也可采用正交试验和方差分析等数学方法来确定培养基的组分和浓度。

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崭新发酵方式的工艺分析2——生产菌种的扩大培养与保宝藏
    微生物工业发酵过程需逐级扩大，不可能将实验室制备的种子直接接种到发酵罐中，因接种量太小，而大大延长菌种的非生产时间，并增加染杂菌的机会。
   菌种的扩大培养是发酵生产的第一道工序，该工序称为种子制备。种子制备不仅要使菌体数量增加，更重要的是经过种子制备培养出具有高质量的生产种子供发酵生产使用。因此，如何提供发酵产量高、生产性能稳定、数量足而且不被其它杂菌污染的生产菌种，是种子制备工艺的关键。
一.种子制备过程
   种子制备一般包括两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程和在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。
（一）孢子制备
  孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。不同菌种的孢子制备工艺有其不同之处。
1.某植物内生丝状真菌的孢子制备
  这种内生真菌是属于水生菌，其孢子的培养不仅可以在静置的液体培养基中进行（即有性孢子），还可以在固体培养基中进行（即无性孢子）；其孢子培养，无论是用 液体培养基，还是用固体培养基都是用人工合成培养基加少量原宿主植物提取液。碳源约为2%~3%，氮源不超过0.5%；其孢子培养温度为摄氏25~30度，培养时间：用液体培养基的为10~15天，产孢子数量多，而用固体培养基的为7~10天，产孢子数量相对少些。
其工艺过程：
菌种——（至）茄子瓶斜面（孢子）——（至）静置液体培养种子（菌丝）——（至）种子罐——（至）发酵罐
或者：
菌种——（至）小广口瓶液体培养（孢子）——（至）静置液体培养种子（菌丝）——（至）种子罐——（至）发酵罐
   这样工艺过程也可将孢子直接接入到种子罐，其具有操作方便，工艺过程简单，便于控制孢子质量。
（二）种子制备
  种子制备是将固体培养基（或液体培养基）上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体。种子制备所使用的培养基和其它工艺条件都要有利于孢子发芽和菌丝繁殖。
1 静置种子制备
将孢子经静置液体培养基培养成菌丝后再进入种子罐，这就是静置种子。静置种子制备是便于控制种子培养，又节约菌种用量。其培养基配方和培养条件与种子罐相似。
2 种子罐种子制备
   种子罐种子制备的工艺过程：是把孢子（或静置种子）接入到体积较小的种子罐中，经培养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子，把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。我们选用二级发酵，由于我们采用的菌种是内生真菌，在把一级种子转入发酵罐的同时，可加入适量的孢子进行发酵，这样可大大提高发酵单位，缩短发酵时间，提高生产效率。
  随着中试的研发，即经验的积累。我们在选定生产目标后，可将种子罐改为预发酵罐。就是把静置种子（菌丝）和适量孢子投入到预发酵罐中，加入基质（即新鲜植物原材料）和蒸馏水，进行缺氧液态发酵3~5天，然后，用2 个预发酵罐的种子接入到1个发酵罐中，接种量约为10%，同时接入少量静置种子（菌丝）和孢子，进行发酵。
二 种子质量的控制
   种子质量是影响发酵生产水平的重要因素。种子质量的优劣，主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件两方面。这就是说既要有优良的菌种，又要有良好的培养条件才能获得高质量的种子。
（一）影响孢子质量的因素及其控制
  孢子质量与培养基、培养温度和湿度、培养时间和接种量等有关，这些因素相互联系，相互影响，因此必须全面考虑各种因素，认真加以控制。
1 培养基
   构成孢子培养基的原材料、其产地、品种、加工方法和用量对 孢子质量都有一定影响。另外，水质的影响也不能忽视。为了避免水质波动对孢子质量的有影响，可在蒸馏水或无盐水中加入适量的无机盐，供配制培养基使用。
   为了保证孢子培养基的质量，培养基所使用的主要原材料、糖、氮、磷含量需经化学分析试验合格后才能使用。制备培养基时要严格控制灭菌后的培养基质量。另外，固体培养基水份适中有利于孢子生长，培养基要用比较单一的氮源。
2  培养温度和湿度
   微生物能在一个较宽的温度范围内生长。但是，要获得高质量的孢子，其最适温度区间很狭窄。一般来说，提高培养温度，可使菌体的糖代谢和氮代谢的各种酶类对温度的敏感性不同。因此，培养温度不同，菌的生理状态也不同，如果不是用最适温度培养的孢子，其生产能力就会下降。不同的菌株要求的最适温度不同，需经实践考察后确定。
   孢子培养时，培养室的相对湿度对孢子形成的速度、数量和质量有很大影响。在一定条件下，培养孢子在北方相对湿度控制在40%~45%，而在南方相对湿度控制在35%~42%，所得孢子质量较好，一般来说，真菌对湿度要求偏高。
3  培养时间
孢子的培养时间对孢子质量有重要影响。孢子的培养时间应控制在孢子量多、孢子成熟，发酵产量正常的阶段终止培养。此时显微镜下可见成串孢子或游离的分散孢子。而如果继续培养，表现为固体培养基表面外观变色、发暗或黄、菌层下陷，有时出现白色斑或发黑。白斑表示孢子发芽长出第二代菌丝，黑色显示菌丝自溶。
4  接种量
   制备孢子时的接种量要适中后，接种量过大或过小均对孢子质量产生影响。因为接种量的大小影响到一定量培养基中孢子的个体数量的多少，进而影响到菌体的生理状态。凡接种后菌落均匀分布整个斜面，隐约可分菌落者为正常接种。一般传代用的孢子要求菌落分布较稀，适于挑选单一菌落进行传代培养。
（二）影响种子质量的因素及其控制
      种子质量主要受孢子质量、培养基、培养条件、种龄和接种量等因素影响，静置种子的质量主要以外观颜色、效价、菌丝密度或粘度以及糖氮代谢、PH变化为指标，符合要求方可进发酵罐。
1  培养基
  种子培养基的原材料质量的控制类似于孢子培养基原材料质量的控制。种子培养基的营养成分应适合种子培养的要求，一般选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基，在营养上容易被菌体直接吸收利用，营养成分要适当地丰富和完全，氮源和维生素含量较高，这样可以使菌丝粗壮，并且具有较强的活力。培养基浓度以略稀薄为宜，培养基的PH要比较稳定。
2  培养条件
  种子培养应选择最适温度，前面已有叙述。培养过程中通气的控制是，培养液经严格消毒灭菌后，如果培养液有沉淀。必须去除沉淀物，使培养液清彻透明。
3  种龄
  种子培养时间称为种龄。在工业发酵生产中，最适种龄一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种，该内生 真菌粗选种龄一般为30~65小时，最适种龄应通过多次试验来确定。
4  接种量
  转入的种子液体积和接种后培养液体积的比例，称为接种量。发酵罐的接种量的大小与菌种特性、种子质量和发酵条件等有关。不同的微生物其发酵的接种量是不同的，该内生真菌的发酵接种量约为7%~15%。
5  种子质量的标准
  判断种子质量的优劣尚需要有实践经验。发酵工业生产上常用的种子质量标准，大致有如下几个方面：
（1）细胞或菌体
  种子培养的目的是获得健壮和足够数量的菌体。因此，菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观是种子质量的重要指标。
  菌体形态可通过观察确定，该内生真菌种子质量要求是，菌丝粗壮，生长旺盛，菌丝分枝正常，菌体有一层一层生长的外观感觉。
  菌体的生长量也是种子质量的重要指标，用光密度法进行测定，其生长旺盛，生长量极大。
  种子液外观如颜色、粘度等也可以作为种子质量的粗略指标。该内生真菌的种子液应清彻透明。
（2）生化指标
  种子液的糖、氮、磷的含量变化和PH值变化是菌生长、繁殖、物质代谢的反映。该内生真菌的种子质量也可以间接的以这些物质的利用情况作为指标。
（3）外分泌物的生成量
     种子液中细胞的胞外多糖的含量的多少是种子生长情况和成熟程度的反映。该内生真菌正是如此。
（4）酶活力
   测定种子液中某种酶的活力，作为种子质量的标准，是一种较新的方法。
（5）有无杂菌污染
    种子应确保无任何杂菌污染。
三  菌种保藏
  微生物工业生产是以与纯培养、菌种质量有着密切关系，而菌种的质量又与菌种制备及保藏有密切关系。因此菌种保藏是微生物工业生产的重要环节。菌种保藏工作的要求在于提高菌种存活率和减少菌种的变异，尽量使菌株保持原来优良的生产性能。
   菌种保藏的基本原理主要是根据菌种的生理、生化特点，人工地创造条件使菌种的代谢活动处于不活泼状态。保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体（孢子、芽胞）；其次是要创造一个最有利于休眠的环境条件，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，即可以达到降低其代谢活动，延长保存期的目的。一个较好的保存方法，首先应能较长期地保存原有菌种的优良特性，使菌种稳定，同时也要考虑到方法本身的经济简便。
   菌种保藏方法可分为斜面低温保藏法、石蜡油封保藏法、砂土保藏法、硅胶保藏法、冷冻干燥法、液氮超低温冻结法等。不同菌种采用不同保藏法，至于具体采用什么方法，那还是要根据具体菌种和具体情况来决定。
   我们所使用的植物内生真菌所采用如下保藏法：
  制备原宿主植物茎细胞提取液，用这种提取液与琼脂混合经灭菌制成所谓固体培养基，它是模仿宿主植物中某种细胞的生态。趁热把这些培养基分装到20瓶小广口瓶中，每瓶装料80ml，培养5~7天后，从中挑选出1~3瓶中培养基表面出现像所谓的酵母菌（实际上不是酵母菌），在它下面生长有我们所需要的菌种（即内生真菌）。这种内生真菌是生长在所谓固体培养基内部的，约一个月左右产孢子，这时将脱脂棉塞改为原玻璃瓶盖，这样其孢子缺氧，进入休眠状态。在一定条件下，用这种方法可保藏内生真菌1~2年。如果万一发生菌种退化，可及时取出使用，恢复原菌种的优良特性。

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崭新发酵方式的工艺分析3（上）——发酵染菌的防止和灭菌
  一.工业发酵染菌的防止
    发酵工业自从采用纯种培养以后，产率有了很大提高，然而，防止染菌的要求也更高了。人们在与杂菌污染的斗争中，积累、总结了很多宝贵的经验。为了防止染菌，使用了一系列的设备、工艺和管理措施。例如，密封式发酵罐，无菌空气制备，设备、管道和无菌室的设计，培养基和设备灭菌，培养过程及其他方面的无菌操作等，大大降低了染菌率。但是至今一些现代发酵工业还遭受染菌的严重威胁，甚至由于染菌而造成巨大的经济损失。染菌仍是发酵工业的致命伤。轻者影响产率，产物提取收得率和产品质量，严重者造成“倒罐”，浪费大量原材料，造成严重经济损失，而且扰乱生产秩序，破坏生产计划。
   染菌对发酵产率，提取收得率，产品质量和三废治理等都有很大影响。然而，生产不同产品，污染不同种类和性质的杂菌，不同的污染时间，不同的污染途径、污染程度，不同培养基和培养条件，所产生后果是不同的。
（一）不同污染时间对发酵的影响
1.种子培养期染菌
种子培养主要是生长繁殖菌体，菌体浓度低，培养基营养丰富，比较容易染菌，带进发酵罐中危害极大，应严格控制种子污染。当发现种子受污染均应灭菌后弃去，并对种子罐、管道进行检查和彻底灭菌。
2.发酵前期染菌
   发酵前期主要是菌体生长繁殖，代谢产物生成很少，这个时期容易染菌，污染后杂菌迅速繁殖，与生产菌争夺营养成分和氧分，严重干扰生产菌的生长繁殖和产物的生成，要特别防止发酵前期染菌。
3.发酵中期染菌
  发酵中期染菌将严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。有的杂菌繁殖后产生酸性物质，使PH值下降，糖、氮消耗迅速，菌（丝）体自溶，发酵液发粘，产生大量泡沫，代谢产物的积累迅速减少或停止，有的已生成的产物也被利用或破坏，有的发酵液发臭。发酵中期染菌，由于营养成分大量消耗，一般挽救处理困难，危害性很大。发酵中期染菌应尽力做到早发现，快处理，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定。
4.发酵后期染菌
  发酵后期产物积累较多，糖等营养物质接近耗尽。如果染菌量不太多，可继续进行发酵；如污染严重，破坏性较大，可以采取措施提前放罐。
（二）染菌的检查、原因分析和防止措施
1.染菌的检查与判断
  在发酵过程中对杂菌污染的及早发现，及时处理，是免除染菌造成严重损失的重要问题。因此，要求有确切、迅速的方法来检出杂菌的污染，目前常用方法主要有以下几种：
（1）显微镜检查
    通常用革兰氏染色法，染色后在高倍显微镜下观察。对霉菌、酵母发酵，先用低倍显微镜观察生产菌的特征，然后再用高倍显微镜观察有否染菌存在，根据生产菌与杂菌的特征区别，判断是否染菌。必要时，可进行芽孢和鞭毛染色。
（2）平板划线培养或斜面培养检查法
   先将经灭菌的固体培养基倒入灭菌的平板中置培养箱摄氏37度，保温24h检查无菌即可使用。将需要检查的样品，在无菌平板上划线，分别置摄氏37度、摄氏27度培养，以适应嗜中菌和低温菌的生长，一般在8h后即可观察。
   噬菌体检查可采用双层平板培养法，底层同为肉汁琼脂培养基，上层减少琼脂用量。先将灭菌的底层培养基熔后倒平板，凝固后，将上层培养基熔解并 保持摄氏40度，加生产菌作为指示菌和待检样品混合后迅速倒在底层平板上，置培养箱保温培养，经12~20h培养，观察有无噬菌斑。
培养基（PH7.0）
          葡萄糖（%）牛肉膏（%）蛋白胨（%）氯化钠（%）琼脂（%）
上层      0.5               1.0              1.0               0.5               1.0
下层      0.5               1.0              1.0               0.5               2.0
（3）肉汤培养检查法
    将需要检查样品接入经灭菌并经过检查无菌的肉汤培养基中，放置摄氏37度和摄氏27度分别培养24h，进行观察，并取样镜检。此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。
   葡萄糖酚红肉汤培养基：牛肉膏0.3%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，蛋白胨0.8%，1%酚红溶液0.4%，PH7.2。
    用以上的检查方法检查未发现污染，还不能肯定未被污染。
   除以上方法外，还可以从发酵过程的异常现象来判断是否染菌，如溶解氧、PH值、排气中CO2含量和菌体酶活力等变化来判断。
2.发酵染菌率和染菌原因分析
（1）发酵染菌率
   发酵的总染菌率是指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比。
   发酵染菌是在发酵罐中发生的染菌率，包括染菌后被挽救不了导致倒罐的批数，但种子罐培养的染菌不接入发酵罐，不导致发酵染菌的另行计算。
（2）染菌原因分析
    在发酵染菌之后，必须分析染菌原因，总结发酵染菌的经验教训，把发酵染菌消灭在发生之前，防患于未然，是积极制服发酵染菌的最重要措施。
    造成发酵染菌的原因很多，但总结归纳起来，其主要原因有：无菌空气带菌、设备渗漏、灭菌不彻底、操作失误和技术管理不善。在发生染菌后，根据无菌试验结果，参考以下方法进行分析，找出原因，杜绝污染。
（A）
   从染菌时间来看，发酵早期染菌，可能原因有：种子带菌，培养基和设备灭菌不彻底，接种操作不当，无菌空气带菌；发酵后期染菌，可能原因有：中间补料污染，设备渗漏，操作问题。
（B）
   从污染的杂菌种类来看，污染耐热的芽孢杆菌，可能是培养基或设备灭菌不彻底；污染球菌、无芽孢杆菌等不耐热杂菌可能是种子带菌，设备渗漏；污染霉菌，一般是无菌室灭菌不彻底或操作问题。
（C）
  从染菌的幅度来看，如果各个发酵罐或多个发酵罐染菌，而且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题；如果各别罐连续染菌，一般是设备问题。
   以上仅仅是在分析问题时作为考虑问题的入门，应根据具体情况综合分析，且通过进一步的无菌检查来验证。
3.杂菌污染途径及预防
（1）种子带菌及防止
   种子带菌的原因主要有以下几方面
（A）培养基及用具灭菌不彻底
     菌种培养基及用具灭菌均在灭菌锅中进行，造成灭菌不彻底主要是灭菌时锅内空气排放不完全，造成假压，使灭菌时温度还达不到要求。
（B）菌种在移种过程中受污染
   菌种的移接工作是在无菌室中，按无菌操作进行。当菌种移接操作不当，或无菌室管理不严，就可能引起污染。因此，要严格无菌室管理制度和严格按无菌操作接种，合理设计无菌室。
（C）菌种在培养过程或保藏过程中受污染
   菌种在培养过程和保藏过程中，由于外界空气进入，也使杂菌进入而受污染。为了防止污染，试管的棉花塞应有一定的紧密度，不宜太松，且有一定长度，培养和保藏温度不宜变化太大。每一级种子培养物均应经过严格检查，确认未受污染才能使用。
（2）无菌空气带菌及防止
   无菌空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。杜绝无菌空气带菌，必须从空气净化流程和设备的设计，过滤介质的选用和装填，过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。
（3）培养基和设备灭菌不彻底导致染菌及防止
    培养基和设备灭菌不彻底的原因，主要与以下几个方面有关
（A）原料形状
  一般稀薄的培养基容易灭菌彻底，而淀粉质原料，特别是有颗粒时，容易由于灭菌不彻底，造成染菌。淀粉质培养基灭菌以采用实罐灭菌为好，在升温时先搅拌混合均匀，并加一定量的淀粉酶边加边液化。
（B）实罐灭菌时未充分排除罐内空气
   实罐灭菌时，罐内空气未完全排除，造成“假压”，使罐顶空间局部温度达不到灭菌要求，导致灭菌不彻底而污染。为此，在实罐灭菌升温时，应打开排气阀门及有关联接管的边阀、压力表接管边阀，使蒸汽通过达到彻底灭菌。
（C）培养基连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底而污染。培养基连续灭菌应严格控制灭菌温度，最好采用自动控制装置。
（D）设备、管道存在“死角”
   由于操作、设备结构、安装或人为造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达预定应该到达的局部灭菌部位，从而不能到达彻底灭菌的要求。这些不能彻底灭菌的部位称为“死角”，“死角”可以是设备、管道的某一部位，也可以是培养基或其他物料的某一部分。管道多指法兰连接处等。
（4）设备渗漏引起染菌及防止
    发酵设备、管道、阀门的长期使用，由于腐蚀、摩擦和振动等原因，往往造成渗漏。例如：设备的表面或焊缝处有砂眼，由于腐蚀逐渐加深，最终导致穿孔；冷却管受搅拌器作用，长期磨损，焊缝处受冷热和振动产生裂缝而渗漏。为了避免设备、管道、阀门渗漏，应选用优质的材料，并经常进行检查。冷却蛇管的微 小渗漏不易被发现，可以压入碱性水，在罐内可疑地方，用浸湿酚酞指示剂的白布擦，如有渗漏时白布显红色。
（5）操作问题
  上面已指出，在菌种培养过程中，如操作不当会引起染菌。在发酵过程如操作不当也引起染菌，如移种时或发酵过程罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；泡沫顶盖而造成污染；压缩空气压力突然下降，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染；等等。防止操作失误引起染菌，要加强对技术工人的技术培训和责任教育，提高工人素质，加强管理措施。
（三）染菌（包括染噬菌体）的处理
1.污染杂菌的处理
   发酵罐污染杂菌后，依据染菌时间、所染杂菌的危害性及时进行处理，同时对所涉及的设备也要及时的处理。
（1）种子罐染菌的处理
  种子罐染菌后都不能往下道工序移种，要及时用高压蒸汽直接灭菌后放下水。
（2）发酵罐染菌的处理
   发酵罐前期染菌，污染的杂菌对生产菌的危害性大，采用蒸汽灭菌后放掉；在发酵的中后期染菌，一是加入适量的杀菌剂抑制杂菌的生长。二是降低培养温度或控制补料量来控制杂菌的生长速度。如果采用上述两种措施仍不见效，就要考虑提前放罐。
（3）染菌后的设备处理
   染菌后的罐体用甲醛等化学物质处理，再用蒸汽灭菌（包括各种附件设备）。在再次投料之前，要彻底清洗罐体、附件，同时进行严格程度检查，以防渗漏。
2. 污染噬菌体的处理
   一般噬菌体污染后往往出现发酵液突然转稀，泡沫增多，早期镜检发现菌体染色不均匀，在较短时间内菌体大量自溶，最后仅残留菌丝断片，平皿培养出现典型的噬菌斑，溶氧浓度回升提前，营养成分很少消耗，产物合成停止等现象。
  发酵过程中污染噬菌体后，一般做如下处理 ：一是发酵液用高压蒸汽灭菌后放掉，严防发酵液任意流失；二是全部停产，对环境进行全面的清洗和消毒，断绝噬菌体的寄生基础；三是更换生产菌种，不断筛选抗噬菌体菌种，防止噬菌体的重复污染。
  污染烈性噬菌体时出现上述现象。如果污染温和噬菌体时，其反应温和，平皿培养不出明显的噬菌斑，只出现部分菌体自溶，生化指标变化不显著，生产能力降低。对生产的危害亦是严重，但不易被发现。防止温和噬菌体污染的方法同上所述。

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崭新发酵方式的工艺分析3（下）——培养基与设备灭菌以及空气除菌
   本节阐述的是一些已被人们所认识的有关培养基与设备灭菌以及空气除菌的基本理论和技术，旨在使更多人们较为系统地掌握和了解这些有关的知识和技术，以便在碰到一些具体染菌实例时，能够分析和找出原因进而提出具体的解决办法和防止措施。
  消毒与灭菌在发酵工业中均有广泛应用。消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。灭菌是指用物理或化学方法杀死或除掉环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。
一.灭菌方法
   灭菌方法主要有：干热灭菌法、湿热灭菌法、化学药品灭菌法、过滤除菌法。根据灭菌的对象和要求选用不同方法。
1. 干热灭菌法
   干热灭菌法是指在干燥高温条件下，将微生物杀死。干热对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒的作用，其中氧化作用是主要的。工业生产中采用的条件是摄氏160度，1h。主要使用于需要保持干燥的器械、容器的灭菌。另外，在接种操作时用的灼烧灭菌法就是最简单的干热灭菌法。
2.湿热灭菌法
   湿热灭菌是借助蒸汽释放的热能和水的参与，能使微生物细胞中蛋白质、酶、核酸分子内部的化学键（特别是氢键）受破坏，特别是蛋白质发生不可逆的凝固性变性，使微生物死亡。
湿热灭菌的优点，一是蒸汽来源操作费用低廉，本身无毒；二是蒸汽具有很强的穿透力，灭菌易于彻底；三是蒸汽具有很大的潜热，蒸汽冷凝后的水分又有利于湿热灭菌；四是蒸汽输送可借助本身的压强，调节方便，技术管理容易。但不能用于怕受潮的物料灭菌，因此被广泛用于工业生产。
3.化学药品灭菌法
  一些化学药品易于微生物细胞中的某种充分产生化学反应，如使蛋白质变性、酶类失活，破坏细胞膜透性而杀死微生物。根据灭菌对象不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。如生产车间环境灭菌，发酵罐污染后的处理，接种操作前人的双手的灭菌，某些器械的消毒灭菌等。发酵工业中常用的化学药品灭菌剂有（1）高锰酸钾溶液，浓度伪.1%~0.25%；（2）漂白粉，用于喷洒生产场地；（3）75%的酒精溶液，常用于皮肤和器具表面杀菌；（4）新洁尔灭和 杜灭芬，一般用于器具和生产环境消毒，浓度0.25%；（5）甲醛、戊二醛常用于器具、仪器、工具和发酵罐内壁等灭菌（6）抗生素等等。
4.射线灭菌法
   通常用紫外线、高速电子流的因阴极射线、X射线等进行灭菌，以紫外线的最常用，由于紫外线的穿透力低，只能用于表面灭菌。一般用于无菌室、培养间等空间灭菌。
二.培养基和设备灭菌
    虽然灭菌的方法很多，但是对培养基和设备的灭菌，以湿热灭菌法最好。
（一）湿热灭菌原理
1.微 生物的热阻
   一般微生物都有一个最适生长温度范围，有一个维持生命活动的温度范围。当环境温度超过维持生命活动的最高限温度时，微生物就会死亡。杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间称为致死时间。在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。热阻是指微生物在某种特定条件（主要指温度和加热方式）的致死时间。一般说灭菌是否彻底，是以能否杀死热阻大的芽孢杆菌为指标。
2.微生物的热死定律——对数残留定律
   微生物的热死是指微生物受热失活，但是物理性质不变。在微生物受热失活过程中，微生物不断地被杀死，活菌数不断减少，其减少速度随活菌残留量减少而减少。菌的死亡速率-dN/dt与任何瞬间残留的活菌数N成正比。
       dN
    -—— =kN                   （3---1）
      dt
式中：N——残留活菌数，（个）；t——灭菌时间，（min ）；k——速度常数，（1/min）。
将式（3---1）积分得
                                       -kt
                     Nt=N0e                     (3--1)
两边取对数：
                  1        N0                              2.303           N0
          t  =  —— ln   —    或        t =————lg ——        （3---3）
                 k           Nt                                 k                Nt
式中： N0——开始时间原有活菌数，（个）；
              Nt——经过t 时间灭菌后残留菌数，（个）
  从（3---3）式中可见，如果要求完全彻底灭菌，即Nt =0，则t为无限大，式（3---3）无意义。事实上也不可能，一般采用Nt =0.001，即1000次灭菌中有一次失败。
3.反应速度常数K是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据，它随微生物种类和灭菌温度而异，在相同温度下，K值愈小，则此微生物愈耐热。
4.培养基灭菌温度的选择
   培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基成分被破坏，在加热下氨基酸及维生素等受破坏。在生产中必需选择既能达到灭菌目的，又能使培养基成分破坏减少至最少的条件。
  灭菌过程微生物死亡是属于一级反应动力学类型见式（3-1），在其他条件不变时，反应速度常数与温度的关系可用阿累尼乌斯方程式表示：
                       -E/RT
     k =Ae        （3—4）
式中，A——比例常数；E——杀死细菌所需的活化能；R——气体常数；T——绝对温度，式（3--4）也可写成：
               -E
          lgk=———— +lgA           （3--5）
              2.303RT
以lgk对1/T标绘得一直线，其斜率为-E/2.303R，截距为A，从斜率和截距可求得A和E值。
培养基成分受热破坏是化学分解反应，为一级动力学，可用式表示：          dC   
            -—— =k`C           （3--6）
              dt
式中：C——反应物浓度，（mol/L）；t——反应时间，（min）；k`——化学反应速度常数，（min），因温度和反应物种类而不同。在化学反应中，其他条件不变时，反应速度常数与温度的关系也可用阿累尼乌斯方式表示：
                   -E`/RT
        k`=Ae       （3--7）
  在灭菌时，当温度变化，菌死亡速度常数k和培养基成分破坏常数k`都变化，温度由T1升高到T2， k值分别为：
                  -E/RT1
            k1=Ae           （3--8）
             -E/RT2
       k2=Ae            （3--9）
将上两式相除取对数得：
              k2   E    1   1
            ln—=——（—- —）         （3---10）
              k1   R    T1  T2
同样灭菌时，培养基成分的破坏也可得类似关系：
              k`2    E`   1   1
            ln—-=——（—- —）          （3---11）
              k`1   R    T1  T2  
将式（3--10）和式（3--11）相除得：
              k2
                 ln——
              k1        E
         ——————=——                 （3--12）
              k`2           E`
           ln——
              k`1
   杀死细菌芽孢的活化能E大于B族维生素破坏的活化能E`。因此，    k2       k`2
         ln—大于ln——即随着温度上升，灭菌速度常数增加倍数
        k1       k`1
大于培养基成分分解的速度常数的增加倍数。也就是说，温度升高，菌死亡速率大于培养基成分破坏的速率。达到相同的灭菌效果，提高灭菌温度可以明显缩短灭菌时间，并减少培养基成分受热时间长使营养成分遭到破坏的损失。
（二）培养基灭菌方法
   工业生产中培养基灭菌方法有分批灭菌和连续灭菌。
1. 分批灭菌
  分批灭菌是将配制好的培养基输入发酵罐内，直接用蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度，这一工艺过程称为分批灭菌或实罐灭菌。这种灭菌方法不需要其他的附属设备，操作简便，是国内外生产中常用的灭菌方法。其缺点是加热和冷却时间长，营养成分有一定的损失，罐利用率低，不能采用高温快速灭菌工艺。……
  实罐灭菌需要有一定的预热时间，以便物料溶胀并均匀受热，预热至摄氏90度以上时，将蒸汽直接通入培养基中，可减少冷凝水量。达到灭菌温度（摄氏121度）时开始计算维持时间（也称保温时间）。为了减少营养成分的破坏，多采用快速冷却方式。在灭菌结束时，立即向开启冷却系统进行冷却。在引入无菌空气前，罐内压力必须低于无菌空气的过滤器压力。种子罐选用分批灭菌。
2. 连续灭菌
  培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌。冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程称为连续灭菌。连续灭菌工艺的特点有：一是可采用高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少；二是发酵罐的非生产占用时间缩短，容积利用率提高；三是热能利用合理，适合实行自动化控制；四是不适合用于粘度大或固形物含量高的培养基的灭菌；五是增加一套连续灭菌设备，增多了操作环节，增加了染菌的机率。
（三）培养基灭菌时间计算
1. 分批灭菌
  如果不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中所有的菌均看作是在保温阶段被杀灭，这样可以简单地利用式（3---1），粗略地求得灭菌所需的时间。
（例 3--1）有一发酵罐内装40立方米培养基，在摄氏121度温度下进行实罐灭菌，原污染程度为每ml，有200000个耐热细菌芽孢，摄氏121度时灭菌速度常数为1.8（1/min），求灭菌失败机率为0.001时所需要的灭菌时间。
解：    N0=4000000*200000=8000000000000（个）
        Nt=0·001（个），k=1·8（1/min）
灭菌时间为：
          2·303   N0   2·303   8000000000000
     t=—————lg—=————lg————————=20·34（
min）     k        Nt    1·8      1/1000
  保温灭菌时间实际上比上述计算的要短。
2·连续灭菌
  连续灭菌的灭菌时间，仍可用式（3--1）计算，但培养基中的含菌数，应改为每ml培养基中的含菌数，则式（3--1）变换为下式：            
           2.303    C0
        t=————lg—             （3--13）
            k       Ct
式中：C0和Ct分别为单位体积培养基灭菌前和灭菌后的含菌数（个/ml）。
（例3--2）若将（例3--1）中的培养基采用连续灭菌，灭菌温度为摄氏131度，此温度下灭菌速度常数为15（1/min），求灭菌所需的维持时间。
解：   C0=200000（个/ml）
        Ct=1/4000000000（个/ml）
            2·303   200000
         t=————lg—————————=2·37（min）
             15      2·5/100000000000
   
(四）培养基与设备、管道灭菌条件
1. 杀菌锅内灭菌
   固体培养基灭菌蒸汽压力0.098MPa，维持20~30min；液体培养基灭菌蒸汽压力0.098MPa，维持15~20min；玻璃器皿及用具灭菌，压力0.098MPa，维持30~60min。
2. 种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等空罐灭菌及管道灭菌
  从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达0.147MPa，维持45min，灭菌过程从有关阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过达到死角灭菌。灭菌完毕，关闭蒸汽后，待罐内压力低于空气过滤器压力时，通入无菌空气保压0.098MPa。
3. 空气总过滤器和分过滤器灭菌
  排出过滤器中的空气，从过滤器上部通入蒸汽，并从上、下排气口排气，维持压力0.147MPa灭菌2h。灭菌完毕，通入压缩空气吹干。
4. 种子培养基实罐灭菌
   从夹层通入蒸汽间接加热至摄氏80度，再从取样管、进风管、接种管进蒸汽，进行直接加热，同时关闭夹层蒸汽进入阀门，升温摄氏121度，维持30min。
5. 发酵培养基实罐灭菌
  从夹层或盘管进入蒸汽，间接加热至摄氏90度，关闭夹层蒸汽，从取样管、进风管、放料管三路进蒸汽，直接加热至摄氏121度，维持30min。
6. 发酵培养基连续灭菌
  一般培养基加热至摄氏130度，维持5min。
7. 消泡剂灭菌，直接加热摄氏121度，维持30min 。
8. 补料实罐灭菌
  根据料液不同而异，淀粉料液加热至摄氏121度，维持5min 。
9. 尿素溶液灭菌，加热至摄氏105度，维持5min。
三. 空气除菌
   空气在引进发酵罐之前进行严格处理，除去其中含有的微生物与其他有毒成分确保发酵正常进行，一是满足生产菌生理代谢对氧的需求；二是在发酵过程中，维持一定罐压，防止杂菌的污染。因此无菌空气的制备需要经过一前期处理过程，构成一个空气处理系统，它是 发酵工程中的一个重要环节。

（一）空气除菌方法
  灭菌的方法很多，但是能够适用于供给发酵需要的大量空气的灭菌和除菌方法主要有，加热灭菌，静电除菌、过滤介质除菌。从经济上、实用上考虑，至今工业上空气除菌几乎都是采用介质过滤除菌。
1.介质过滤除菌
   使空气通过经高温灭菌 的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中，而达到除菌目的。
（二）介质过滤除菌
  过滤除菌是工业生产中广泛使用的除菌方法，按过滤除菌机制不同而分为绝对过滤和深层介质过滤。绝对过滤是利用微 孔滤膜，其孔隙小于0.5微米，甚至小于0.1微米，而深层介质过滤孔隙大于0.5微米，这种除菌不是真正过滤作用，而是靠静电，扩散、惯性和阻截等作用将细菌截留在滤层中。
  介质过滤，由于介质的理化性质，介质的填充方法、厚度、空气流速等不同，其过滤效率也有较大差异。其除菌效率随气流速度增大而降低，当气流速度增大到某值时，除菌效率最小，此速度称为临界速度。
1.介质过滤效率
     介质过滤效率是指被介质层捕集的尘埃颗粒与空气中原有颗粒数之比，即：
                       N1-N2      N2
       介质过滤效率  =———=1- ——=1-P        
                        N1        N1      
式：  N1——过滤前空气中的尘埃颗粒数；
      N2——过滤后空气中尘埃颗粒数；
      P——穿透率，即过滤后空气中残留颗粒数与原有颗粒数之比。
   根据介质过滤除菌机理，它不是面积过滤，而是依靠很多细小的纤维将空气中粒子拦截在介质层中，因此过滤效率是随滤层厚度的增加而提高的。另外在介质过滤中，过滤介质使用时间长，滞留的带菌微粒就有可能穿过，所以过滤器必须定期灭菌。
2.影响介质过滤效率的因素
  介质过滤效率与介质纤维直径关系很大，在其他条件相同时，介质纤维直径越小，过滤效率越高。对于相同的介质，过滤效率与介质滤层厚度、介质填充密度和空气流速有关。
（1）介质填充厚度与过滤效果的关系
  在装填密度不变时，在一定范围的空气流速下，随维尼纶和棉花的填充密度增加，可提高过滤效率。
（3）空气流速与过滤效率的关系
   在空气流速很低，当气流速度增加到临界值后，过滤效率随气流速度增加而提高。空气流过过滤层所产生的压力降，直接影响操作费和通气发酵效率。因此，在选择过滤介质时，要考虑到过滤效率高，又要使压力降小。
（三）空气过滤除菌的工艺流程
   工业发酵过程中为得到无菌空气，一般采用如下工艺流程：
空气吸气口——（至）粗过滤器——（至）空气压缩机——（至）一级冷却器——（至）二级冷却器——（至）分水器——（至）空气贮罐——至）旋风器——（至）空气加热器——（至）总空气过滤器——（至）分过滤器——
   该工艺流程主要目的，一是提高压缩前空气的质量（洁净度）；二是去除压缩空气中所带的油和水；三是再加热到摄氏30~35度，最后通过总过滤器和分过滤器（有的不用分过滤器）除菌，从而获得洁净度、压力、温度和流量都符合工艺要求的无菌空气。
（1）提高压缩前空气的质量
   压缩空气站应在生产车间的上风向，一般空气吸入口以离地面5~10米为好，吸气口处应装置筛网防止吸入杂物。粗过滤器可减少往复式空气压缩机活塞和汽缸的磨损，减轻介质过滤除菌的负荷。
（2）去除压缩空气中所带 的油和水
   压缩空气由于温度高（摄氏120~150度）而不能直接进入空气过滤器，因此需通过空气冷却器将温度冷却到摄氏20~25度，一般一级空气冷却器是采用摄氏30度左右水将压缩空气冷却到摄氏40~45度，二级冷却器，用摄氏15~18度地下水，进一步将压缩空气冷却到摄氏20~25度。冷却后的空气其相对湿度提高到100%，用空气贮罐来沉降大的油滴、水滴和稳定压力，用旋风分离器分离5微 米以上的液滴。
（3）无菌空气的获得
   用加热器将空气贮罐中相对湿度100%的空气，加热到摄氏30~35度，同时使相对湿度降低到60%，以保证过滤器在干燥状态下工作，空气经过总过滤器和分过滤器除菌后即能得到符合工艺要求的无菌空气。
四.崭新发酵方式中制服染菌的要点
  由于该发酵的特点是，发酵罐是以新鲜植物材料为基质，进行的是缺氧液态发酵。在发酵过程中，保持一定罐压，即大于一个大气压。因此，重点防止污染的阶段是种子罐（包括种子罐）以前的这些阶段。为此，对发酵过程中涉及的空气净化系统，设备系统，蒸汽质量，工艺操作提出下述要求。
1.对空气净化系统的要求
   防止空气净化系统带菌的主要措施有，提高空气进气口的空气洁净度；除尽压缩空气中夹带的油和水，保持过滤介质的除菌效率。另外，在过滤器灭菌时要防止过滤介质被冲翻或烧灼。由于使用无菌空气的量少，可考虑使用绝对过滤，即TPFE。
2.对蒸汽的要求
  首先要重视蒸汽质量，一般采用饱和蒸汽，严格控制蒸汽中的含水量，按照不同灭菌工艺要求提供稳定的蒸汽压力，灭菌过程中蒸汽压力不可以大幅度的波动，保证灭菌质量。
3.对设备的要求
   发酵罐及其附属设备应作到无“渗漏”，无“死角”。凡与物料、空气、下水道连接的管件阀门应保证严密不漏，蛇管和夹层应定期试漏。连续灭菌设备要定时拆卸清洗。无菌操作室和接种培养间定期消毒。以保持无菌状态。
4.对工艺操作的要求
  种子罐移种、发酵罐放罐后，对罐体和附属设备进行全面清洗和检查，清除罐内的残渣，除尽罐壁上的污垢，清除罐内附件处的堆积物。
  配制培养基时要防止物料结块或带入异物，配料罐和输送料液系统要定时清洗消毒。
  在实罐灭菌、空罐灭菌、培养基连接灭菌、各种管道的灭菌等的操作过程中要严格执行工艺规程要求。灭菌中要保证蒸汽畅通，保证蒸汽压力与温度的对应关系。
  菌种组的工作人员要 严格按工艺规程制备生产种子。对进入无菌室的全部物料，器械实行灭菌。坚持无菌间和无菌操作人员的菌落检测制度。
  发酵过程的无菌检查工作，要严格取样操作，力求减少取样和平皿划线时的操作失误。严格镜检岗位的操作要求，降低无菌检查中的错判和误判。种子罐、发酵罐后期染菌，要及时查明杂菌来源，并采取相应措施予以处理。
  对空气 净化系统、补料系统、接种系统等要严格管理，加强无菌检查。

topmit

文章太长了,适合发酵入门的学习,里面的一些观点和说法也是发酵人值得深思的.有兴趣的,给出文章链接地址:


http://bioon.net/user1/1110/archives/2006/78856.shtml