PCR技术的基本原理

细履平沙

PCR技术的基本原理　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的
寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
　　①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增
形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引
物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
　　③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶
序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制
链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又
可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放
大几百万倍。(Plateau)。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

　　PCR的反应动力学　 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终
的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩
增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理
论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的D
NA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称
平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多
数情况下，平台期的到来是不可避免的。


　　PCR扩增产物 　可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定
在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结
合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中， 以两条互补的DNA
为模板，引物是从3'端开始延伸， 其5'端是固定的，3' 端则没有固定的止点，长短不一，
这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即
“长产物片段”)结合。引物在与新链结时， 由于新链模板的5'端序列是固定的， 这就等于
这次延伸的片段3'端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内
、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加， 而“长产
物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就
能保证足够纯DNA片段供分析