大肠杆菌包涵体中目的蛋白含量分析问题

wzhenjun

大家好，内容有点多，主要想说的明白点，辛苦了

最近做大肠杆菌产重组蛋白两三个月了，由于蛋白是存在于包涵体中的，检测手段比较困难，我们目前只是通过破碎菌体后做电泳测目的蛋白带灰度，同时测定菌体总蛋白，暂时认为灰度值和总蛋白的乘积为目的蛋白量。这样虽然很不准确，但是做过很多次之后稳定性还是可以的，所以也就作为发酵产量的一个指标。

得到菌体后，高压匀浆破碎菌体，得到破碎原液，将破碎原液离心得到包涵体和离心上清液。分别用同样的方法测破碎原液，包涵体和破碎上清液中目的蛋白，发现破碎上清电泳没有目的条带（现在就算破碎上清中有很少目的蛋白，电泳无法测出），包涵体中有。

于是问题出现了：包涵体和破碎上清液中目的蛋白量应该与破碎原液中目的蛋白量相当才对，可现在是离心后包涵体和破碎上清中目的蛋白之和远远低于破碎原液中目的蛋白量，大概少了70%—50%的样子。

面对问题，考虑过是破碎液中的成分影响了分析，因此也换过PBS缓冲液，结果是一样的。有没有可能是破碎过程中解离出的大量目的蛋白，但是在离心过程中被蛋白酶给解离了？

有没有哪位高手能帮我分析下？？感激不尽

sulei

1，菌体电泳中会有很多带出现，包涵体带就占一部分，你现在需要的就是包涵体，其他的没有用。
2，破碎时体积增大许多，再跑电泳有些带已经不清楚了，没法通过灰度分析确定。
3，包涵体比较稳定，在破碎不易降解，除非你的破碎条件十分苛刻。

wzhenjun

说的对，极大多数包涵体还是完好的。

胖女孩

wzhenjun

这个问题不纠结了，这种方法本身就是不对的。

zdx9966

这个试验本身就不怎么严谨