α-淀粉酶检验方法

luyafei414 · 发表于 2010-5-25 08:31:48

α-淀粉酶检验方法

１  范围
本办法适用于α－淀粉酶的检验。
２  引用标准
QB/T  2306-97
３  原理
α－淀粉酶能将淀粉分子链中的α－1，4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝黑色的特异性反应，随淀粉降解蓝色逐渐减褪，渐变成红棕色，其颜色消失的速度与酶活性有关，故可在标准条件下，通过测定反应后溶液的吸光度计算其酶活力。
４  酶活力的测定
４．１  试剂和溶液
４．１．１  原碘液
称取碘化钾22.0g溶于约300ml水中，加入碘11.0g，在搅拌下使其溶解，然后移入500ml容量瓶中，贮于棕色瓶中备用（每月制备一次）。
４．１．２  稀碘液
称取碘化钾20.0g溶于约300ml水中，准确加入原碘液2.00ml，全部移入500ml容量瓶中，用水定容，贮于棕色瓶中备用（当天配制）。
４．１．３  20g/L可溶性淀粉溶液
称取可溶性淀粉（以绝干计）2.000g，精确至0.001g，用水调
成浆状物，在搅动下缓缓倾入70ml沸水中，然后，以30ml水分几次冲洗盛淀粉的小烧杯，洗液并入其中，加热煮沸2min直至完全透明，冷却至室温，全部移入100ml容量瓶，用水稀释至刻度，此溶液须当天配制。
４．１．４  磷酸缓冲液（PH=6.0）
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）45.23g、柠檬酸（C6H8O7•H2O）8.07g，用水溶解并定容至1000ml，配好后，用PH计校正。
４．１．５  盐酸溶液C（HCI）=0.1mol/L，按GB60配制。
４．２  仪器和设备
４．２．１  分光光度计；
４．２．２  恒温水浴  50℃-100℃精度±0.1℃；
４．２．３  试管  25mm×200mm；
４．２．４  容量瓶
４．２．５  吸管
注：①采用浙江菱湖食品化工联合公司生产的，标有“专供酶制剂测定”用的字样和批号的“可溶性淀粉”。
４．２．６  秒表
４．３  待测酶液的制备
４．３．１  液体酶制剂：
直接用缓冲液（3.1.4)配制，使最终酶液浓度控制在65-70μ/ml范围内。
４．３．２  固体酶制剂：
称取酶粉1-2g，精确至0.0002g，先用少量磷酸缓冲液溶解，并用用玻璃搅棒捣研（或用磁力搅拌器搅拌），直至固体全部溶解（约10-15min），将上清液小心倾入容量瓶中，用缓冲液稀释至刻度（使酶浓度控制在65-70μ/ml范围内，摇匀。通过四层纱布过滤，收集滤液供测定用。
４．４  测定
４．４．１  吸取可溶性淀粉溶液20.0ml和缓冲液5.0ml于试管中，在70℃恒温水浴中预热平衡5min。
４．４．２  加入稀释好的待测酶液1.00ml，立即用秒表记录时间，摇匀，准确反映5min。
４．４．３  立即用吸管吸取反映液（3.4.2)1.00ml，加到预先盛有0.1mil/L盐酸0.5ml和稀碘液5.00ml的试管中，摇匀。
４．４．４  以0.1mol/L盐酸0.5ml和稀碘液5.00ml的混合液作试剂空白，于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定其吸光度（A）。根据吸光试查附录A（标准的附录），求得测试酶液的浓度（C）。
４．５  计算
X=C×n×16.67
式中：X——样品的酶活力，μ/ml（u/g）；
   C——测试酶的浓度，μ/ml；
   n——样品的稀释倍数；
16.67——换算系数。
４．６  结果的允许差
平行试验相对误差不得超过2%。