酪酸梭状芽孢杆菌培养条件的研究

kxgkxg

酪酸梭状芽孢杆菌（clostridium butyricum）是一种革兰氏阳性厌氧内生芽胞杆菌[1]。芽孢巨大，生成芽孢后或一端膨大成鼓锤状，或中部膨胀成纺锤状或梭状。其对人畜无毒；可抑制肠道有害菌，促进有益菌生长；能减少肠内氨、胺含量（这两种物质会损害肝功能）；产生多种维生素，如维生素K等；产生多种酶类，提高饲料利用率，促进动物生长[2]。作为微生态制剂功效显著，并能与抗生素配伍使用[3]。
目前广泛应用的非芽孢类活菌制剂（如乳酸菌）普遍存在保存期短，活性不稳定的缺点，给实际应用带来很多困难，这个问题在动物用微生态制剂上尤为明显。由于动物用微生态制剂的补充是通过饲料添加途径，而在此过程中不可避免的要经历某些高温或特殊pH的生产、运输及饲喂环节。而非芽孢类活菌制剂在这种情况下，其活性会大大降低，进而严重影响使用效果。因此本试验的目的就是要在获得酪酸菌最大菌体得率的同时提高芽孢转化率，以提高其对各种恶劣的环境因素的抗性，延长制剂保存期，稳定活性。
为了获得最高的酪酸菌菌体得率和芽孢转化率，我们对培养基成分，接种量，培养时间，菌种优化方法进行了研究，并对生长过程进行48h观测，得出了生长过程中菌体浓度、 pH、芽孢形成率等因素的变化规律和相互关系。并在100L发酵罐上进行了扩大培养，效果良好。

1 材料与方法

1.1 菌种
JSMCB，江苏省微生物研究所保藏。
1.2 试剂
葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、胰蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏、NaCl、（NH4）2SO4、K2HPO4、MgSO4、MnSO4、NaHCO3、CaCO3，孔雀绿染液，蕃红染液。以上试剂均为国产分析纯试剂。
1.3 基础培养基
葡萄糖0.5％、牛肉蛋白胨1.0％、酵母膏0.5％、NaCl 0.2％、K2HPO4 0.4％、CaCO3 0.1%。

1.4 器材
TH-GB-403型超净工作台，江苏省无锡县空气净化设备厂；PYX-DHS-40X恒温培养箱，上海市跃进医疗器械一厂；123MB-1型光学显微镜，Nikon；XB-K-25型血球计数板，上海医乐医用光学仪器厂。

1.5 培养方法
液体深层静置培养：250ml三角瓶装液量200ml，于37℃恒温培养箱中静置培养。
1.6 检测方法
菌数测定用血球计数法、菌体形态用芽孢染色法[4]染色后于显微镜下观察。
2 结果与分析
2.1 培养基成分试验
2.1.1 碳、氮源配比试验
调节碳、氮源种类和添加量，为菌体生长提供足够的营养，从而使菌体浓度达到最大。

2.1.1.1 不同碳源对菌体浓度的影响
分别以1.0％葡萄糖，3.0％蔗糖，3.0％乳糖，3.0％可溶性淀粉为碳源，代替基础培养基中0.5％的葡萄糖，基础培养基中其它成分不变，对酪酸菌进行液体深层静置培养。培养24h，结果见表1。试验结果表明以葡萄糖为碳源培养效果最好。


2.1.1.2 葡萄糖添加量对菌体浓度的影响
以葡萄糖为碳源，分别用0.3％、0.5％、1.0％、1.5％4个用量水平进行培养，基础培养基中其它成分保持不变。培养24h结果见表2。




试验结果表明，葡萄糖添加量1.0％，1.5％时菌体浓度最大，但从节约成本角度考虑，葡萄糖添加量1.0％为最佳。
2.1.1.3 不同类型蛋白胨对菌体浓度的影响
分别以1.0％的酪蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉蛋白胨、大豆蛋白胨代替基础培养基中1.0％的牛肉蛋白胨，其它成分不变，培养24h，结果见表3。由试验可知1.0％胰蛋白胨的培养效果最好。


2.1.1.4 氮源配比对菌体浓度的影响
鉴于酪酸菌的生长需求，本试验以胰蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏为复合氮源，代替基础培养基中的牛肉蛋白胨、酵母膏，并进行不同添加量配比试验，培养24h，结果见表4。由试验可知第5组氮源配比最佳：胰蛋白胨1.0％、酵母膏0.5%、牛肉浸膏0.3％。

2.1.1.5 培养基碳、氮源配比确定
由上述试验可确定培养基碳、氮源配比为葡萄糖１．０％、胰蛋白胨１．０％、酵母膏０．５％、牛肉浸膏０．３％。并以此碳、氮源配比替代原基础培养基中的碳、氮源，其它成分不变，培养２４ｈ后菌体浓度达到5．５×１０８个/ｍｌ。

2.1.2 无机盐及微量元素配比试验
在前述碳、氮源配比的基础上已经可以获得较高的菌体浓度，现调整培养基中无机盐及微量元素配比以提高芽孢转化率。主要考虑因素如下：①当有机氮源充足时适量的添加无机氮源有利于菌体生长，故添加硫酸铵；②添加Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋可促进芽孢形成[５]，故添加Ｋ２ＨＰＯ４、ＭｇＳＯ４、ＭｎＳＯ４； ③由于酪酸菌在生长过程中大量产酸，使得ｐＨ值降辐很大，而ｐＨ值过低不利于菌体形成芽孢[６]，所以添加碳酸氢钠和碳酸钙以调节ｐＨ。试验结果见表５。

由试验可知无机盐及微量元素对菌体浓度的影响不大，而对芽孢转化率有较大影响。其中第5组无机盐及微量元素配比最佳。NaCl 0.2％、（NH4）2SO4 0.1％、 K2HPO4 0.4％、MgSO4 0.05％、MnSO4 0.02％ 、NaHCO3 0.1％、 CaCO3 0.1％时芽孢转化率最大。

2.1.3 培养基成分确定
最终确定培养基配方如表6所示。以下各试验均采用该培养基。



2.2 酪酸菌接种量对菌体浓度及芽孢转化率的影响
接种量大小对培养结果有一定影响，接种量过大会带入较多的种子培养期的代谢产物，并使菌体前期生长过快，而使最终菌数下降。接种量过小则使菌体增殖缓慢，培养时间延长。试验分别采用了3%、5%、10%、15%4个接种量进行培养，培养20h结果见表7。由表可见在培养20h时,15%接种量组已进入稳定期，但菌体浓度并不是最高；3%、5%接种量组仍处于指数期，生长过慢，因此10%为最佳接种量。



2.3 培养时间对酪酸菌菌体浓度及芽孢转化率影响
培养时间是影响菌体浓度及芽孢转化率的重要因素。本试验取不同培养时间进行观察，结果见表8。试验结果表明，培养时间过短，菌体浓度尚可，但芽孢转化率和成熟率都过低。但时间过长，芽孢转化率和成熟率并无明显提高，反而出现菌体老化，菌数下降的情况。试验表明36h为最佳培养时间。

2.4 加热菌种对酪酸菌菌体浓度及芽孢转化率的影响
酪酸梭菌为内生芽孢杆菌，此类芽孢杆菌的优选及复壮常采用热处理方法。热处理不仅能激活芽孢，使其尽快萌发[7]，而且还能有利于菌体同步培养及污染防治。据此本试验将加热、不加热的菌种进行对比试验。具体操作为，将相同的菌种分出一部分，于80℃加热10min后接种，每隔一定时间取样检测。结果见表9。



从试验结果可见，加热组的菌体生长最旺盛。而非加热组虽然芽孢形成较早，但最终得率不高，且菌体衰老较快。故判断加热可活化菌种。

2.5 酪酸菌培养过程观测
将菌种于80℃加热10min后以10%的接种量接种于上述培养基中静置培养，对培养期间的菌数、pH值、芽孢转化率、芽孢成熟率等参数进行观测，结果见表10，图1，图2。




从观测结果可看出，培养过程中各参数的变化之间是有对应关系的。菌体生长与pH值的下降基本是同时开始的，当pH下降放缓直至最低点时，菌体生长到达指数期末，进入稳定期。芽孢形成在指数期就已经开始，在稳定期末芽孢转化率达到最大，培养36h后芽孢成熟率也达到最大。随着芽孢形成并逐渐成熟，pH有回升的现象，这主要是由于芽孢形成过程中，菌体组织分离脱落，使孢内碱性物质溶出，另外也与芽孢形成过程中菌体的代谢有关。

2.6 中试
依照上述培养条件，酪酸菌在100L发酵罐中进行扩大培养，培养36h菌数达到6.5×108个/ml，芽孢转化率达到95％，扩大培养效果良好。

2.7 菌粉制备
将发酵罐中获得的菌液离心，收集菌体。用蒸馏水清洗后，40℃干燥后粉碎。按1：1的比例加入辅料（麸皮等）后，制成成品。成品中菌体数可达3.0×108个/g。

3 小结与讨论
酪酸梭菌培养的关键问题就是要在获得较高菌量的同时提高芽孢转化率。芽孢生成是菌体正常生活史中的一个阶段，是一种积极的状态变化过程。此过程应是在适宜的培养环境中，菌体生长良好的条件下，由多方面因素协同作用的结果。通过上述试验可见，葡萄糖1.0％、胰蛋白胨1.0％、酵母膏0.5％、牛肉浸膏0.3％，适量合适的无机盐类，接种前活化菌种，接种量10％，培养36h可获最大菌体浓度和芽孢转化率。

涛声依旧

正在做这个品种，谢谢楼主的上传，我在五吨发酵罐内菌数只做到1×108个/ml，有点偏低，希望以后能和你多多交流

kxgkxg

现在，我们每毫升能做到5-6个亿

涛声依旧

你那是多大的罐子？

fangbu

请教一下你们调PH时碱用空气压还是用氮气？我们这儿用空气，我感觉不好。

fangbu

请教一下你们调PH时碱用空气压还是用氮气？我们这儿用空气，我感觉不好。

kxgkxg

可以加我，1059239932