质谱在糖分析中的应用

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100多年前德国著名科学家E.Fischer开始了糖的研究，1923年M.Heidelber和T.Oswald提出细菌的抗原部分是多糖而不是蛋白质，因此，糖类的生命科学几乎与蛋白质的生命科学同时诞生。但是，糖类的研究远远落后于蛋白质和核酸研究，这主要是因为过去认为糖类在生物体内的主要作用是作为能量资源，例如动物体内储存的糖元和植物体内储存的淀粉，或者是作为结构材料，例如植物细胞的纤维素等，而且，糖类的纯化处理和结构鉴定都较为困难。近来，由于对糖类的生物学功能有了新的认识，例如糖结合物在细胞识别、细胞间物质运输和对免疫功能的调节等方面的作用，同时由于多糖以及糖结合物的分离、纯化、组分测定和结构分析有了长足的进步，因此关于糖类的研究又引起人们的重视。
　　由于糖在生物学上的重要意义决定了其在医学领域有广阔的应用前景。现有的研究表明：一些多糖有调节淋巴细胞、吞噬细胞、白介素、抗体水平以增强免疫功能，有抗肿瘤(提高宿主免疫力和对肿瘤细胞呈细胞毒作用)、抗感染(提高宿主免疫力和直接杀菌、抗病毒作用，尤其在肝炎、风湿病和爱滋病上应用价值大)、抗消化性溃疡、降血糖、降血脂、抗血栓、抗辐射，抗毒物损伤、抗晕、祛痰镇咳、诱导干扰素的产生、促进血功能恢复以及促进蛋白质和核酸的生物合成等方面的生物活性。
　　糖类化合物包括单糖及其衍生物、寡糖、多糖、复合多糖和糖苷类。复合多糖包括糖蛋白和糖脂两大类。要阐明一种糖结构，必须了解：(1)分子量；(2)单糖残基实质；(3)单糖残基间的顺序；(4)单糖残基在糖苷键中的位置；(5)环状结构的类型；糖苷键的构型。
　　传统的化学和生化测定方法有酸水解、甲基化分析氧化裂解、酶解、碱解、旋光度测定及平均分子量测定等。近年来，核磁共振仪、X-射线衍射光谱、电子显微镜、激光拉曼光谱和红外光谱及GLC，TLC，HPLC，HPCE，超临界色谱(SFC)和亲和色谱等也都用于糖类分析。由于糖的组分复杂，结构相似，加之糖没有显色基团，难以不经衍生就进行光谱、色谱分析，故糖的分析难度较大，质谱较为有效地克服了这一困难。

1　质谱在糖分析中的应用

　　质谱对糖类化合物的分析开始于60年代，由于最初不能直接测定热不稳定的、不易挥发和极性强的生物大分子，所以糖化合物须进行衍生化。例如，多糖样品全甲基化保护羟基，水解得到部分甲基化的单糖混合物后，用硼氢化钠还原，再乙酰化得到部分甲基化链状多羟基醇的乙酰衍生物，应用GC-MS测定混合物，可了解单糖组成及大致的分枝情况。
1.1　快原子轰击电离质谱　80年代初期质谱软电离技术如快原子轰击电离质谱(FAB-MS)和液态二次离子质谱(LSI-MS)的出现使糖的分析有了很大的进展。其原理为，一束高能粒子，如氩、氙原子，射向存在于液态基质中的样品分子而得到样品离子，这样可以得到提供分子量信息的准分子离子峰和提供化合物结构信息的碎片峰。测定寡糖样品时，FAB-MS 的典型灵敏度为1 nmol样品/μL基质，少于核磁所需样品的百分之一，并可以比EI和CI-MS提供更多的序列信息。Peter-Katalinic等测定了1～10 nmol含有25个糖残基的天然及衍生的糖磷脂的序列。Reinhold等分析了全甲基化和全乙酰化的寡糖和糖肽，这些化合物的分子量为5 000～15 000 u。寡糖还原端的衍生方法的发展使LSI-MS可以更好的分离pmol量级的糖混合物。最近,Lacko用FAB-MS测定了重组人体血浆中LCAT的N-连接糖结构。
1.2　电喷雾质谱　1985年，Fenn等首先报道了大气压电喷雾(ESI)质谱系统，其电喷雾的过程如下：(1) 喷雾器顶端施加一个电场给微滴提供净电荷；(2) 在高电场下，液滴表面产生高的电应力，使表面被破坏产生微滴；(3) 荷电微滴中溶剂的蒸发；(4) 微滴表面的离子“蒸发”到气相中，进入质谱仪。为了降低微滴的表面能，加热至200～250℃，可使喷雾效率提高。该方法已被证明是研究糖结构的一种非常有效的分析方法。FAB-MS可以显示碎片离子，但只能产生单电荷离子，因此不适用于分析分子量超过分析器质量范围的分子。ESI可以产生多电荷离子，每一个都有准确的小m/z值。此外还可产生多电荷母离子的子离子，这样就可以产生比单电荷离子的子离子更多的结构信息。此外，ESI-MS可以补充或增强由FAB获得的信息，即使是小分子也是如此。 那些因没有分子离子或只有nmol量级而不能用FAB检测的大分子寡糖，即使样品只有pmol量级且未经衍生，也可以使用ESI分析。因此，ESI-MS成为当前分析大分子糖及复合物的最好方法之一。Garozzo等［14］使用负离子ESI-MS识别了吡喃葡萄糖的β1位与葡萄糖的C-2，-3，-4以及-6连接形成的不同二糖。Mulroney将此方法扩展到异头物分析。Yoshimi用HPLC和ESI-MS对不同阶段小鼠脑中N-连接寡糖成分变化的检测为研究N-连接寡糖对中枢神经系统发展所起的作用提供重要线索。
　　寡糖的质谱分析可以从完整的分子离子峰中得到单糖的组成信息，从碎片离子中获得一些序列或分支的信息。但要得到更多的信息，如环的切割方式等，同时降低化学噪音就要使用CID或MS/MS。大的多电荷离子可以被中性靶气体有效地碰撞解离(CID)，是ESI-MS中最为引人注目的发展,是阐明结构的一种必不可少的技术，而且可以区分自然界存在的同分异构体。在过去的几年中，CID已被用于ESI-MS中分析未经衍生的N-连接寡糖和N-连接糖蛋白的双电荷系列。
　　ESI离子阱质谱因其可以完成多级碎裂(MSn)，因此是一种有效的分析部分甲基化N-连接糖蛋白的寡糖部分方法。
1.3　基体辅助激光解吸-电离质谱　1991年，Stahl报道了用基体辅助激光解吸-电离质谱法(MALDI-MS)精确地测定ng量级的葡聚糖(糊精)，相对分子质量达7 000 u。显示了这一新技术可快速(数分钟1个样品)、准确(可达几千分之几)、高灵敏度(nmol量级)测定大分子多糖相对分子质量的能力，开辟了糖化合物分析的新途径。基体辅助激光解吸飞行时间质谱法即为基体辅助激光解吸离子化技术在飞行时间质谱分析仪中的应用。MALDI就是采用短的脉冲激光(1～10 ns)使样品分子离子化后进入质谱仪分析。使用MALDI-TOFMS方法测定了完整的糖蛋白的分子量也已有报道。还有用MALDI-TOFMS法测定了pmol和fmol量级的糖肽。Papac等提出以2,5-二羟基苯甲酸(DH 为基体，用反射MALDI-TOFMS法在正离子方式下测定中性糖组分；用2,4,6-三羟基苯乙酮(THAP)为基体，用线性MALDI-TOFMS法，在负离子方式下测定酸性糖组分。由于糖组分缺少可质子化的碱性部位，故常用MALDI-TOFMS测定的是糖的金属离子复合物，但灵敏度较低。
　　全甲基化及其他衍生方法可以提高MALDI和ESI的灵敏度。Navev等利用Girard's T试剂［H2NNHCOCH2N+(Me)3］与糖衍生化后，使灵敏度提高了10倍，并且不需除去过剩的衍生化试剂。Powell等采用衍生化的方法将寡糖末端的唾液酸转化成甲基酯，避免了MALDI-TOFMS测定过程中唾液酸的丢失，同时抑制了唾液酸与盐产生多重MS峰，可在一次正离子方式测定中同时获得中性和酸性糖信号。Takao等提出了糖的4-氨基苯甲酸-2-(二乙基氨)乙基酯的高灵敏度衍生化方法，使灵敏度提高了400倍。Solouki等用傅立叶变换离子回旋共振质谱［MALDI-FTICR MSn(n>2)］分析部分甲基化糖，提供了比一级解离更多的结构信息。源后解离质谱(MALDI/PSD-MS)也是一种可选择分析部分甲基糖的方法。
　　最近，Rydlund等用毛细管区带电泳和MALDI-TOFMS测定了桦树牛皮纸浆酶解后所得的寡糖结构。赵善楷以2，5-二羟基苯甲酸(DH +间硝基苄醇(NBA)混合基体辅助激光解吸-电离质谱法分析甲壳素降解并衍生化的寡链糖，获得了满意的结果。
　　ESI-MS和MALDI-TOFMS在分子量测定的灵敏度、准确性和对复杂体系分析能力方面均比以前的技术有了显著的改善，大大拓宽了质谱技术在糖分析中的应用，但仍存在不少问题需要解决。如，ESI的多电荷离子使谱图解析复杂化且对样品要求高，不能有盐和表面活性剂；MALDI-TOFMS的分辨率低，结构信息有限，基体的选择仍是凭经验，对于基体辅助的机理仍不是很清楚，联用困难。

2　色-质联用技术在糖分析中应用

　　质谱法在一次分析中可提供丰富的结构信息，将分离技术与质谱法相结合是分离科学方法中的一项突破性进展。用质谱法作为气相色谱(GC)的检测器已成为一项标准化GC技术被广泛使用。由于GC-MS不能分离不稳定和不挥发性物质，所以发展了液相色谱(LC)与质谱法的联用技术。LC-MS可以同时检测糖肽的位置并且提供结构信息。例如Carr等发展了LC-MS方法识别N-,O-连接糖蛋白寡糖结构。Melo等首次从植物细胞分泌的糖蛋白中发现了人体的Lewisa型决定体，用MALDI-TOFMS测定了天然蛋白的分子量及其中寡糖结构的初步测定，并用HPLC-ESI-MS 进行了进一步的分析。Szpunar等用分子排阻色谱与ICP-MS联用测定了水果和蔬菜中金属和糖的络合物，该方法可以检测分子量大于50 ku的多糖。Feurle等用β-环糊精键合的HPLC柱与ESI-MS-MS联用分离分析磷酸化糖，并成功地用于监测丙酮酸和磷酸甘油醛在转羟乙醛酶催化下反应生成1-deoxyxylulose-5-phosphate。Torto等用高效阴离子交换色谱与离子喷雾质谱联用使用阳离子交换膜在线除盐，监测除盐后的糖的水解产物。我们采用LC/ESI-MS/MS方法，研究了正品肉苁蓉及其代用品盐生肉苁蓉和管花肉苁蓉中的苯乙醇苷类化合物。发现3种肉苁蓉中苯乙醇苷类化合物的种类和含量有较大区别，并通过对特征碎片进行母离子扫描，预测具有相似结构的一类化合物。我们还采用LC/ESI-MS/MS方法对地黄、人参、黄芩和　木等中药中苷类化合物及食品中糖类进行分离分析并对其裂解方式进行研究。
　　1987年首次报道了毛细管电泳(CE)与质谱的联用技术，随之该项技术就迅速获得认可和欢迎。CE-MS在一次分析中可同时得到迁移时间、分子量和碎片信息，因此它是LC-MS的补充。最早报道CE与MS联用是脱机方式，后来还有CE与等离子体质谱、MALDI-TOFMS和ESI-MS联用。Kelly等用CE-ESI-MS和MS/MS分离鉴定了摩拉克氏菌属细菌(Moraxella catarrhalis)的脂寡糖和多糖。Yeung等用CE-ESI-MS分析了高甘露糖的糖蛋白，该方法适用于中性高甘露糖的多糖，而且不需要将释放或衍生寡糖。我们用HPCE，HPLC，MALDI-TOFMS，CE-ESI-MS和LC-ESI-MS完成了CHO细胞中rHuEPO的结构测定。用HPCE分离了rHuEPO的6种糖型；用CE-ESI-MS和LC-ESI-MS对O-连接糖肽进行分析；用MALDI-TOFMS测定了rHuEPO的分子量。Monsarrat等将CE-ESI用于分析APTS衍生的lipoarabinomannans (LAMs)中甘露寡糖Caps，电泳选用三乙基胺甲酸水溶液作缓冲液代替常用的磷酸缓冲液更适于质谱检测。
　　CE-MS作为常规方法尚存在以下缺点：浓度灵敏度低，不如LC-MS；不是所有的CE分离模式都可方便地与MS联用；MS对CE分离缓冲液的限制较多。因此需进一步研究分离能力强的CE技术与MS相联用的可靠方法，研制新型的高效CE-MS接口，使CE的各种类型的缓冲液都适用。
　　总之，随着质谱仪器的进一步完善，对机理进一步了解，谱图解析工作的进一步深入，如建立较完整的谱库，色质联用技术的进一步发展，相信质谱技术将成为糖分析的有力工具，完成糖的分子量、序列、组成及连接的测定，对目前正在发展的糖生物学和糖基化工程将起到极大的推动作用。