生物工艺学(下)教案 3楼有附件

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生物分离的基本概念

生物分离是从生物材料、微生物的发酵液、生物反应液或动植物细胞的培养液中分离并纯化有关产品（如具有药理活性作用的蛋白质等）的过程，又称为下游加工过程。   生物分离过程的主要特点    常无固定操作方法可循    生物材料组成非常复杂    分离操作步骤多，不易获得高收率    培养液（或发酵液）中所含目的物浓度很低，而杂质含量却很高    分离进程必须保护化合物的生理活性    生物活性成分离开生物体后，易变性、破坏    基因工程产品，一般要求在密封环境下操作。 生物分离的一般工艺流程

发酵液→预处理→细胞分离→（ 细胞破碎→细胞碎片分离 ） →初步纯化→高度纯化→成品加工

注：（1）胞内产物需经细胞破碎，细胞碎片分离等步骤；胞外产物则将细胞去除后，对余下的液体即可进行初步纯化。

（2）在初步纯化及其以前的各步操作，处理的体积较大，着重于浓缩，称为提取或分离；以后各步为精细的分离操作，着重于纯化，称为精制（或纯化）。

生物分离的各阶段的常用方法

（1）发酵液的预处理      加热        n    调pH n    絮凝和凝聚

（2 ）固液分离 n    沉降 n    离心分离 n    过滤 n    错流过滤 （3）细胞破碎 n     机械法  高压匀浆、高速珠磨、超声波破碎         n     非机械法       化学法、酶解法、渗透压冲击法、冻结融化法、干燥法 （4 ）初步纯化 n    沉淀法 n    吸附法 n    萃取法 n    超滤法 （5）高度纯化 n    层析 亲和层析、凝胶层析、离子交换层析 n    电泳 n    结晶和重结晶 （6 ）成品加工 n    无菌过滤 n    去热原 n    干燥、冷冻干燥、喷雾干燥 n    制剂 生物分离方法的选择依据 n    传统生物药物（抗生素）

根据具体条件，通过小实验决定，选择时应考虑两个因素。

（1）抗生素的理化性质：极性、酸碱性、溶解度等，了解其理化性质，通常利用纸层析和纸电泳的方法。

（2）抗生素的稳定性：要了解它在什么样的pH和温度范围易受破坏。

纸层析

抗生素在某一种溶剂中的Rf值大，表明它在该种溶剂中溶解度大；相反，如Rf值小，则溶解度小。如Rf为零，则说明不能溶解。如抗生素在极性强的溶剂中有较大的Rf值，则表明该抗生素是极性化合物；而非极性抗生素在非极性溶剂中Rf值较大，在极性溶剂中Rf值较小。

纸电泳

通过纸层析判断为水溶性的抗生素，可用纸电泳法进一步判断其电离性质。

电泳结果与样品性质的判断见课本第六页表1-1。

生物分离方法的选择依据

n    基因工程药物

应根据目标蛋白和杂蛋白在物理、化学和生物化学方面性质的差异，如，生物特异性、分子量、等电点值和稳定性等。当几种方法联用时，最好以不同的分离机理为基础，且前一种方法处理过的液体应能适于后一种方法的料液。

作业

n    胞内产物和胞外产物的分离纯化流程有何不同之处？

n    哪些方法比较适合生物物质的初步纯化？哪些方法比较适合生物物质的高度纯化？

n    以抗生素为例说明，选择生物分离方法时主要要考虑哪些因素？

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第一章  预处理及固液分离

第一节  发酵液（培养液）的预处理    预处理的目的   ?  改变发酵液（培养液）的物理性质，以利于固液分离。主要方法有：加热、凝聚与絮凝、使用助滤剂。   ?  去除发酵液（培养液）中部分杂质以利于后续各步操作。     预处理的方法 一、加热     加热是最简单和经济的预处理方法，即把发酵液（培养液）加热到所需温度并保温适当时间。加热能使杂蛋白变性凝固，从而降低发酵液（培养液）的粘度，使固液分离变得容易。但加热的方法只适合对热稳定的生物活性物质。  预处理的方法 二、凝聚和絮凝     凝聚和絮凝在预处理中，常用于细小菌体或细胞（分泌胞外产物）、细胞的（分泌胞内产物）碎片以及蛋白质等胶体粒子的去除。其处理过程就是将一定的化学药剂预先投加到发酵液（或培养液），改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，再进行分离。但是应当注意，凝聚和絮凝是两种方法，两个概念，其具体处理过程也是有差别的。  1．凝聚         凝聚是指在某些电解质作用下，破坏细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。     凝聚剂主要是一些无机类电解质，由于大部分被处理的物质带负电荷（如细胞或菌体一般带负电荷），因此工业上常用的凝聚剂大多为阳离子型，分为无机盐类、金属氧化物类。常用的无机盐类凝聚剂有：Al2（SO4）3?18H2O（明矾）、AlCl3?6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等；常用的金属氧化物类凝聚剂有：Al(OH)3、Fe3O4、Ca(OH)2或石灰等。           2．絮凝      絮凝是指使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子量聚电解质），在悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程。      常用的絮凝剂有聚丙烯酰胺、聚氧化乙烯、、聚丙烯酸钠和聚苯乙烯磺酸。      影响絮凝效果的因素很多，主要是絮凝剂的分子量，絮凝剂用量，溶液pH，搅拌速度和时间等。

三、使用惰性助滤剂

工业生产中有时需加入某些固体物质，以加速过滤速度，提高滤液质量，这种能提高过滤速度的物质称为助滤剂

助滤剂的使用方法有两种：①在过滤前先在过滤介质表面预涂（铺）一层助滤剂。②助滤剂按一定比例均匀加入待过滤的料液中。

常用的惰性助滤剂有硅藻土、珍珠岩、混合助滤剂（硅藻土或珍珠岩与石棉）、纤维素和活性炭。

助滤剂的选择要点如下：

（1）粒度选择

（2）根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂的品种

（3）用量选择

四、去除杂蛋白质的其它方法

1．等电点沉淀

蛋白质在等电点时溶解度最小，能沉淀而除去。

2．变性沉淀

使蛋白质变性的方法有：加热、大幅度改变pH，加有机溶剂（丙酮、乙醇等）、加重金属离子如Ag＋ 、Cu2＋ 、Pb2＋等、加有机酸如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸、鞣酸、过氯酸等及表面活性剂。

3．吸附

在发酵液中，加入一些反应剂，它们互相反应生成的沉淀物对蛋白质具吸附作用而使其凝固。

预处理的方法

五、不溶性多糖的去除

当发酵液中含有较多不溶性多糖时，粘度增大，液固分离困难，可用酶将它转化为单糖以提高过滤速度。例如在蛋白酶发酵液加α－淀粉酶，将培养基中多余的淀粉水解称单糖，就能降低发酵液粘度，提高滤速。

预处理的方法

六、高价金属离子的去除

对提取和成品质量影响较大的无机杂质主要是Ca2＋、Mg2＋、Fe3＋等高价金属离子，预处理中应将它们除去。

?   去除钙离子，常采用草酸钠或草酸。

?   镁离子的去除也可用草酸，但草酸镁溶解度较大，故沉淀不完全，也可采用磷酸盐，使生成磷酸钙盐和磷酸镁盐沉淀而除去。

?   除去铁离子，可采用黄血盐，形成普鲁士兰沉淀：

作业：

?  改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些？其简要机理如何？

?  除去发酵液杂蛋白的常用方法有哪些？

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第二节  细胞破碎

一、概念      破坏细胞壁和细胞膜，使胞内产物得到最大程度的释放。 二、影响细胞破碎的因素      1、细胞壁的结构      2、破碎方法 细胞壁的结构 ? 细菌 　革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层（约20－80nm）组成，而革兰氏阴性菌肽聚糖层较薄，仅2－3nm，在肽聚糖层外还有两层外壁层。外壁层约8－10nm，可见革兰氏阳性菌细胞壁较厚，较难破碎。 　　 ? 霉菌   霉菌的细胞壁较厚，约100－250nm。 ? 酵母菌   酵母的细胞壁比革兰氏阳性菌的细胞壁厚，更难破碎。  　　　　　　　　　　　　　　 破碎方法 ?  机械法 高压匀浆法 高速珠磨法 超声波破碎法 ?  非机械法 化学法 酶解法 物理法：渗透压冲击法、冻融法 干燥法 1、非机械法   A、高压匀浆法      适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。不适用于高度分枝的微生物。 B、高速珠磨法：利用玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌，由于研磨作用，使细胞破碎。 C、超声波破碎法：实验室常用 影响因素：频率、液体温度和粘度、处理时间等。   2、非机械法 A、化学法：采用化学试剂处理细胞，溶解细胞或抽提细胞组分   B、酶解法     利用酶（溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明质酸酶等）反应分解破坏细胞壁上特殊的键，以达破壁的目的。需与其它方法配合使用（辐射、渗透压冲击、反复冻融法等） ?   途径：在细胞悬液中加酶或采用自溶作用 ?   自溶作用：利用微生物自身产生的酶来溶菌，而不需外加其它的酶 ?   自溶的方法：     加热法、干燥法 C、渗透压冲击法      先把细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂。 D、冻结-融化法   将细胞放在低温（-150C），然后在室温中融化，反复多次，细胞壁破裂。       E、干燥法        经干燥后的菌体，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。 方法：空气干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥   三、破碎率的评价 细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：                Y(%)=[(N0-N)/N0]×100 N0－原始细胞数量  N－经t时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量   目前N0和N主要通过下面的方法获得 ： ? 直接计数法 在血球计数板用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。 ?  间接计数法     间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（例如可溶性蛋白、酶等）。通过做法是将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体（完整细胞和碎片），然后用Lowry法测量上清中的蛋白质含量。 四、各种破碎方法的评述 ?   高压均浆和珠磨两种机械破碎方法，处理量大，速度非常快，目前在工业生长上应用最广泛。但在机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，而易造成生化物质的破坏，特别是在超声波处理时。因此，超声波振荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎。   ?   非机械法一般仅适用于小规模应用。渗透压冲击和冻结－融解法都属于较温和的方法，但破碎作用较弱它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎效果。干燥法属于较激烈的一种破碎方法，容易引起蛋白质或其它组分变性.    五、破碎方法的选择依据 ?处理量 高压匀浆和珠磨机处理量大，速度快，适用于工业生产 ?产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性以及产物在细胞中的位置 生化物质的稳定性 ?细胞的数量和细胞壁的强度 ?破碎程度 ?提取分离的难易     总之，适宜的细胞破碎条件应该从高的产物释放率、低的能耗和便于后续提取这三方面进行权衡。

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第三节  固液分离

? 固液分离：是指将发酵液（或培养液）中的悬浮固体，如细胞、菌体、细胞碎片以及蛋白质等的沉淀物或它们的絮凝体分离除去。
一、固液分离设备
?  过滤设备
    板框压滤机
    真空鼓式过滤机
?  离心设备
   过滤式离心机
   沉降式离心机
  
1、过滤设备
?  板框过滤机
原理    
特点    板框压滤机的过滤面积大，能耐受较高压力差，对不同过滤特性的料液适应性强，同时还具有结构简单，造价较低，动力消耗少等优点。但这种设备不能连续操作，设备笨重，占地面积大，非生产的辅助时间长（包括解框、卸饼、洗滤布、重新压紧板框等）。
适用对象  广泛应用与培养基制备的过滤及霉菌、放线菌和酵母菌和细菌等多种发酵液的过滤 。

2、离心设备
?  过滤式离心机
     转鼓上开有小孔，转鼓内表面覆盖过滤介质，在离心力的作用下，液体穿过过滤介质经小孔流出，固体被截留在过滤介质表面。主要用于处理悬浮液固体颗粒较大、固体含量高的场合。
?  沉降式离心机
     转鼓上无小孔，不需要过滤介质，在离心力的作用下，固体沉降于鼓壁上，余下的即为澄清的液体。适用于固体量较低（小于10％）的场合。常用的沉降式离心机有碟式离心机和管式离心机。
二、过滤方式
?  常规过滤
料液流动方向与过滤介质（能使固液混合料液得以分离的某一介面）垂直。

?  错流过滤
料液流向平行于过滤介质。过滤介质通常为微孔膜或超滤膜。

三、影响固液分离的因素
?  微生物种类
   真菌的菌体大，固液分离容易，可采用鼓式真空过滤或板框过滤；细菌和细胞碎片小，固液分离较难，固液分离前要采用一些手段增大粒子。
?  发酵液黏度
   固液分离速度与黏度成反比
?  其它因素
   发酵液的PH值、温度和加热时间
四、固液分离的发展动向
   改善固液分离的手段主要从下列三方面进行：
?  利用错流过滤
?  利用遗传工程的方法来改变菌体的大小和形状
?  采用双水相萃取处理细胞匀浆液
作业：
1.简述常用细胞破碎方法的原理、特点及适用范围。
2.简述常用过滤设备的原理、特点及适用范围。
四、固液分离的发展动向
   改善固液分离的手段主要从下列三方面进行：
?  利用错流过滤
?  利用遗传工程的方法来改变菌体的大小和形状
?  采用双水相萃取处理细胞匀浆液
作业：
1.简述常用细胞破碎方法的原理、特点及适用范围。
2.简述常用过滤设备的原理、特点及适用范围。