2003年中国微生物学会学术年会暨八届三次理事大会

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2003年中国微生物学会学术年会暨八届三次理事大会
论文集
大 会 报 告

微生物基因组研究与今天的微生物学
赵 国 屏
中国微生物学会分子微生物学及生物工程专业委员会
（国家人类基因组南方研究中心 上海 201203 中科院上海生命科学院植物生理生态所 上海 200032）
　　"微生物学学科的研究对象决定了它有如下两方面的显著特点：微生物作为最简单的生命体而成为生命科学研究不可替代的基本材料，由此也奠定了微生物学在生命科学中的基础地位；微生物极其丰富的生物多样性决定了它们具有代谢产物多样性，同时又与人类、动植物和环境有着密切的相互作用，使得微生物学也成为应用领域里十分活跃的一门学科。"（摘自《国家自然科学基金1999年度项目指南》）近年来，得益于人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）的推动，微生物学又一次发挥了它独特的优势，率先进入了基因组和功能基因组的时代。
　　微生物的全基因组测序工作起始于对病毒（噬菌体，如φX174，λ等）基因组的研究。自人类基因组计划将大肠杆菌（Escherichia coli）和啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）列入其模式生物范畴后，对枝原体（Mycoplasma）和枯草杆菌（Bacillus subtilis）的全基因组测序工作也就开展起来了。但是，由于采用了崭新的方法，TIGR率先于1995年发表了1.8Mb长，含有1743个基因的流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）基因组全序列。这是人类第一次完成了对一个能独立生活的生物体的全基因组序列的测定。此后，微生物基因组测序的工作进展极为迅速，成果日新月异。时至今日，绝大部分基因组较小的重要病原微生物及极端环境微生物（特别是古菌，Archaea）的代表种的基因组测序工作已经完成；对工业及环境微生物的全基因组测序工作，以完成天蓝色链霉菌的全基因组测序为标记，已经全面展开，出现了加速发展的新局面。
　　基因组学研究是遗传学、分子遗传学发展的必然结果。微生物与微生物学在这一历史过程中一如既往，发挥了它们独特的、不可取代的作用。例如物理图谱与Contig的建立，基因组克隆载体的构建等几个重大突破点，都含有微生物或微生物学的贡献。而成功实现对微生物基因组进行全基因组测序的一个重要贡献，就是突破了对人类和其他高等生物的全基因组测序的测序战略和诠释这两方面的技术瓶颈。
微生物分子遗传学的研究在功能基因克隆和基因表达调控这两方面自上世纪70年代以来，获得了一系列成果，并且得到了极大的普及。在微生物生理生化、微生物分类和系统学研究、以及工业、农业和医学微生物等方面都实现了全面的应用。新生的基因组学研究，特别是微生物的功能基因组研究，不仅为传统的微生物学研究领域注入了新的内容，而且更将为比较生物学、分子进化和分子生态学研究开辟新天地，为转录组、蛋白质组和代谢组的研究奠定基础。与应用研究结合，微生物基因组研究在医学（包括免疫）和新药研制方面的潜力已得到科学界和产业界的广泛的注意。
　　面对这一激动人心的新时代，我们必须承认，基因组研究给人类带来了生物学知识的大爆炸，给生物学研究带来了技术、方法、思维和理论的大革命，也为生物技术（包括医药、大农业和资源环境）带来了革命性发展的原动力。我国的微生物学和遗传学工作者对此不能视而不见，妄自菲薄。我们既要紧紧抓住中国的资源特色，国情特点，努力工作，锐意创新；又要紧紧抓住生物信息学所提供的机遇，尽快利用国际研究成果，将今天的微生物学迅速有效地推进到基因组与功能基因组研究的高度上去。同时，我们更要积极地将基础研究与生物技术的创新与发展结合起来，让基因组时代的微生物学为我国国民经济的可持续发展作出新的贡献。
基于核糖体RNA基因序列分析的酵母菌物种鉴别：现状与问题

白 逢 彦
中国微生物学会真菌学专业委员会
(中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学开放研究实验室 北京 100080)
　　核糖体rRNA基因转录间区(ITS)和大亚基rRNA基因(26S rDNA) D1/D2区域的碱基序列是目前酵母菌分子分类学研究中最常用的依据。几乎所有已知酵母菌种模式菌株的D1/D2序列已被测定；所有已知担子菌酵母和多数已知子囊菌酵母菌种模式菌株的ITS序列也已被测定。这些rDNA碱基序列的公开，为酵母菌的鉴定带来很大便利，同时也提高了酵母菌鉴定的准确性，使酵母菌分类学研究者愈来愈依赖于rDNA序列分析进行物种鉴别。目前在本领域比较公认的观点是，具有相同D1/D2或ITS序列的酵母菌，应属于同一个种；在D1/D2或ITS序列中碱基差异大于1%的菌株，则应属于不同的种。
　　然而，近几年我们自己和其它研究者的研究结果表明，无论是ITS区还是D1/D2区，用于酵母菌物种鉴别和确认时都有其局限性，主要表现在：1) 因具有相同或相似D1/D2序列而被认为是同物异名的酵母菌，会具有显著不同的基因组组成，包括染色体条数和染色体DNA分子大小；2) 具有相同或相似D/D2 区序列的酵母菌，会具有完全不同的ITS 序列，反之亦然；3) 同一酵母菌种内不同菌株的ITS序列差异幅度，有时远大于1%，可达2%或更高；4) 酵母菌种间的ITS序列差异，有时是连续的；5) 有些酵母菌种一个个体细胞内，存在D1/D2 和ITS序列多态性，不同拷贝间的碱基差异，可达1%以上。本报告将通过实例，对上述问题进行详细讨论。

AM真菌在可持续农业发展中的作用
李 晓 林
中国微生物学会农业微生物学专业委员会
（中国农业大学资源与环境学院 北京 100094）
　　丛枝菌根是自然界中普遍存在的植物与真菌的共生体，即真菌侵染植物的根在根系内形成根内结构，并延伸到土壤中形成菌丝网。真菌从植物获得生长所需要的碳水化合物和一些生长物质，其菌丝可以从土壤中吸收矿质营养元素和水分等，通过菌丝内部的原生质流快速地将它们运转到植物体内，供植物生长需要，从而形成互惠共生体。菌根真菌在自然界的分布极为普遍，90%的有花植物都形成丛枝菌根。利用菌根真菌"生物肥料"的营养作用，可以降低速效化肥的用量，从而减轻硝态氮对地下水和地表水资源的污染程度；利用菌根真菌提高植物抗土传病害的作用，可以减少部分农药的使用量以减轻对土壤、水资源和大气的污染；利用菌根真菌能提高植物抗旱性的作用，可以增强山旱薄地植物的抗旱性，促进生长，并有利于水土保持；接种菌根真菌可显著提高苗木移栽成活率，对荒山造林、水土保持、增加森林覆盖率具有重大意义。本文就菌根共生体的生物学特性,在农业和生态系统中的作用及其机理进行了探讨。
含孤对电子元素的杂环微生物代谢研究
许 平
中国微生物学会基础微生物学专业委员会
（山东大学微生物技术国家重点实验室 济南 250100）
　　自然界存在有着重要研究意义的孤对电子杂环化合物，如含硫、含氮、含氧类杂环化合物。这些化合物在制药、食品添加剂、环境保护等领域起着重要作用。我们研究小组近年来，在生物降解这些杂环化合物的理论和实践中做了一些研究工作，在也正在初步开展一些杂环如含氮化合物吡嗪的生物合成的研究工作，谢谢各位专家指正。
　　我们实验室分离得到的耐热菌株分枝杆菌X7B可以以DBT为唯一硫源进行生长，沿着"4SM"途径，先生成2－羟基联苯，再生成2－甲氧基联苯。进一步研究表明，菌株X7B同样可以以苯并噻吩（Benzothiophene，BTH）为唯一硫源进行生长。通过GC/MS分析，表明脱硫产物是o-羟基苯乙烯。最近几年，发现能够专一性降解BTH的菌株，主要包括戈登氏菌株（Gordonia sp.）213E，类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）A11-2，红球菌（Rhodococcus sp.）T09，中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）KT55以及红球菌KT462。这些菌株的BTH降解途径已分析较清楚，其中Paenibacillus sp. A11-2, Sinorhizobium sp. KT55和Rhodococcus KT462的BTH降解途径是：BTH à BTH sulfoxide à BTH sulfone à benzo[e][1,2]oxathiin S-oxide à o-hydroxystyrene。而Gordonia sp. 213E和Rhodococcus sp. T09菌株BTH降解途径和上面的类似，只不过降解BTH的终产物不是o-hydroxystyrene，而是2-(2'-hydroxyphenyl) ethan-1-al。根据报道，可以同时脱除DBT及BTH中硫的菌株仅有两株，即Paenibacillus sp. A11-2和Rhodococcus KT462。通过PCR扩增获得X7B脱硫基因，长度为3720个碱基，其中dszA，从1－1362；dszB为1359－2456；dszC为2467－3720。三个基因是同向转录的，dszA的终止密码子和dszB的起始密码子重叠，在dszB和dszC之间有一个11个bp的缺口。在NCBI进行比对，结果表明菌株X7B脱硫基因和红平红球菌IGTS8有99%相似性。
　　从土壤中分离得到一株能以咔唑作为唯一氮源的高效降解菌株，经生理、生化特征及16S rDNA序列分析，该菌株定名为Pseudomonas sp. XLDN4-9。XLDN4-9休止细胞（OD620 3.0）能在4 h内将500 mg l-1的咔唑彻底降解(84.2 mg h-1 g-1细胞干重)。该菌株对其他杂环化合物吡啶、吲哚、喹啉也具有一定降解能力，其休止细胞体系对吡啶、吲哚、喹啉的降解能力分别为36.5 mg h-1 g-1细胞干重、12.9 mg h-1 g-1细胞干重、12.3 mg h-1 g-1细胞干重，其降解能力受诱导影响。在休止细胞对咔唑的降解产物中有黄色产物生成，经GC/MS测定分析有邻氨基苯甲酸的存在，且该菌株能利用邻氨基苯甲酸生长，证明XLDN4-9与文献报道的多株菌可能具有类似的咔唑降解途径，即咔唑在有角度的双氧化酶作用下的间位裂解途径。另外该菌也能利用咔唑结构类似物：含硫杂环化合物（二苯并噻吩）及含氧杂环化合物（二苯并呋喃），这与有角度的双氧化酶作用底物宽泛性的报道相一致，从而使该菌株具有较高的实际应用价值。另外该菌株对异喹啉、氮杂蒽也表现出一定降解能力，但对咔唑的烷基衍生物9-甲基咔唑无降解能力。
进行分子内或分子之间的共价交联聚合，直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织、甚至器官的结构、性质与功能。TG在哺乳动物、鸟类和鱼类等广泛存在，在机体各种各样的生命代谢过程中发挥着重要的作用，但动物型TG都是Ca++依赖型的，组织特异性很高，含量少，分离精制过程很复杂，因而价格十分昂贵，严重地其应用研究的发展。
　　1 国外微生物转谷氨酰胺酶的研究开发
　　由于具有在蛋白质之间架桥形成ε-(γ-Glu)-Lys的异型肽键、将蛋白质共价交联聚合，从而直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能性质的特性，TG在食品和医药工业等具有广泛的用途，特别在食品工业中可用于加工各种食品蛋白质，进行碎肉重组制造组织强化食品，生产诸如人造肉、风味豆制品、低脂肪保健肉制品、低盐保鲜海产品、增稠定型乳制品、以及可食性包装保鲜薄膜等各种新型食品。
　　可见，TG在食品加工中的有用性极高，可开发的潜在能力很广泛。日本的科研人员首先发现了新的不依赖于Ca++的微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)，1989年发表了利用链轮丝菌（Streptoverticillium sp.）直接发酵生产MTG，解决了TG产品生产受来源和数量制约的问题。随后也报告了不少包括酶的分离提纯、酶的基本结构分析和酶分子结晶构造、菌体本身的酶基因和化学合成基因的在大肠杆菌等的克隆表达等基础性研究以及酶在各种食品加工中的广泛应用等一系列科研成果。德国、荷兰等一些国家和地区的研究人员也相继报道了发酵产酶的结果。而且日本味之素公司在1993年成功地在将该酶制剂推向日本国内市场，此后，MTG系列产品被大批量生产和广范围加工应用，其年产值迅速增加，2001年的MTG产品产值已超过3000万美元，一支独秀，成为单一酶种类中利润最高的商品酶，占日本酶制剂工业总产值的30%，而其他多种常见的酶制剂产品基本上保持历年同样水平或只是略有增加而已。
　　2 微生物转谷氨酰胺酶生产菌的育种
　　MTG的研制开发引起了国内外研究者的广泛兴趣和高度重视，目前，国内酶发酵生产与应用总体上都还处在实验室水平，现在还没有工业化产品生产。
　　通过几年来对MTG研究和发展的持续不断的关注，以及开展大量的实验研究工作，我研究院成功地改良发展了日本味之素公司的生产技术，有效地简化和提高了产酶微生物育种工作。首先根据产酶微生物的自身特性和酶催化反应结果的特征性质，建立起了一个从土壤中筛选MTG生产菌株的高效快速、经济性的合理技术路线，有针对性地采集各种典型土样，利用廉价的酶作用底物设计了蛋白质交联凝絮-沉淀性能测定试验方法作为初筛手段，并摸索开发出一种新的经济性MTG产生菌育种模型，既避免了在菌种的初筛过程中就直接测定MTG活性而需要大量使用价格昂贵的酶作用底物的缺点，节省时间精力和经费开支，又可以大批量地筛选菌种。从而增大了育种的定向性，获得了一系列生产MTG的微生物菌株，并进行了分类鉴定，将其归属定名为链霉菌（Streptomyces sp.）WZFF.W-12等。实验结果表明这些该菌株与目前与所报道的MTG生产菌株以及相应的茂原链霉菌（Streptomyces mobaraensis）的代表菌株JCM4168在形态特征和多种理化性能方面相差很大，确定了这一菌株为新的安全性MTG生产微生物菌种。
　　实验根据所确定有效的产酶菌株选育技术方法，进一步进行了诱变育种研究。将该土壤放线菌的孢子经预培养处理使其处于萌发状态下制备成单孢子悬浮液后，以亚硝基胍（NTG）单独和结合羟胺复合进行的多次诱变试验。通过比较诱变处理后一些菌落的形态状况如颜色、边缘、生长速度和大小等的变异情况与产酶能力性状，分析总结了相互间密切联系的特征与规律。并根据这一性质初步判断突变株的产酶性能，从而有针对性地挑取与产酶能力有关联的形态变异性诱变菌落，缩小高产菌株的筛选范围，大幅度地减少了因盲目挑选所需要的大量工作量以及时间、精力的浪费，明显提高了产酶菌株的正突变率，得到了高酶活菌株。然后，再经过初筛分析和复筛验证，获得了产酶性能良好、遗传形状稳定的一系列MTG高产突变株，最高的酶活相对提高了近8倍。
　　3微生物转谷氨酰胺酶的发酵生产研究
　　利用通过诱变处理得到的这些高产酶菌株，实验首先在摇瓶条件下，对MTG发酵生产过程中采用的主要发酵培养基组成、发酵培养条件对菌体生长和产酶能力的影响作用进行了实验分析比较，确定了发酵生产MTG的合适碳氮源种类及其最佳碳氮比，以及包括接种龄、接种量、初始pH值、培养温度、搅拌速度等适宜的工艺条件。实验并发现了羟胺和己胺等多种产酶诱导剂对菌体产酶有显著的促进作用和协同效果，而且加入一些蛋白酶抑制剂有利于菌体产酶或者稳定酶活。
接着进行了发酵生产水平的系列放大研究，从利用自行设计的小型便易的2L生化反应器起200L发酵罐，逐步加大发酵罐规模，深入研究包括通气量、搅拌速度等多种可直接在线监测控制的条件因素、以及发酵培养基的流加补料操作策略对罐发酵产酶的影响作用，完成了5 000 m3发酵罐的中试规模发酵生产工艺试验，MTG活性可以连续稳定保持在2.75 U/mL之上。
　　4 酶制剂的分离提纯
　　MTG产品的生产根据实际需要分为粗酶制剂的提取制备和纯化产品的提纯精制两部分，经过深入研究，完善了一套与酶发酵生产相对应匹配的粗酶制剂和纯酶产品分离提纯的高速、有效措施条件。酶制剂的粗提主要采用硫酸铵盐析法，发酵液离心弃去菌体后的上清液经过超滤浓缩器处理后得到超滤浓缩液，再经过各浓度硫酸铵的盐析沉淀以及乙醇抽提后得粗酶液，透析后真空干燥得粗酶产品。
该粗酶制剂活力平均在80 U/g以上，酶活的总回收率在80%以上，各项理化指标都高于规定要求，产品稳定性高。该酶产品已在香肠、火腿等肉食品加工中良好应用。
　　在纯酶的精制过程中，粗酶先后以CM-Sepharose CL-6B弱酸性阳离子交换树脂柱和Blue-Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析分离，并分别进行透析和超滤浓缩后冷冻干燥等处理，获得纯化120倍以上的高精度酶制剂产品。该纯化酶在SDS-PAGE上显示出单一条染色带。整个纯化精制过程中，纯化酶的平均回收率在28%以上。经分析测算该纯酶产品的活性在17.4 U/mg以上，分子量为41.5Kda，等点电9.2，最适pH和反应温度分别为6.1～6.5和45℃，在pH5.5～9.0和55℃下稳定，表现为Ca++不依赖性。该酶已经在利用大豆分离蛋白等制备植物蛋白性的可食性保鲜膜的生产加工中应用。
　　5 高产酶菌株的空间诱变育种研究
　　虽然上述采用常规诱变育种方法所得到的MTG生产菌株的总体性能已达到较高的水平，产酶能力等接近国外已报道的水准，但还有潜力有待挖掘，因此，有必要采用新的技术方法进行强化训育提高。
　　近年来，我国宇宙航天科学技术事业发展相当迅速，同时我国研究人员利用返回式卫星等开创了空间育种技术，进行了粮油蔬菜、瓜果等作物种子和幼苗等的搭载育种试验，选育出了高产优质的新品种和新品系，取得了较好的经济效益，显示出了良好的社会影响效果。然而，迄今为止有关微生物菌种搭载育种的成功试验结果尚未见报道。
　　我研究院在中国空间技术研究院有关部门的帮助下，将MTG菌株Streptomyces sp. WZFF.L-M168和WZFF.W-12.var HZ3等送上搭载了"神舟"四号无人飞船，开拓性地进行微生物菌种的空间诱变育种实验。
　　考虑到利用航天新技术及设备进行空间育种技术研究的实验机会很有限，搭?quot;神舟"四号飞船受到数量及试验项目内容限制等因素，搭载之前进行了地面模拟空间环境因素的探索研究，有针对性地分别开展与搭载相对应的比较性诱变育种试验，对了解空间诱变机理、设计空间诱变育种试验内容、明晰空间诱变育种对产业化可持续性发展的指导作用都有明显的实验研究价值和直接的实际作用意义。为了做到实现飞船搭载的定向诱变育种和扩大诱变选育效果的目标，实验对搭载菌株进行严格挑选，并针对空间环境的长期微重力状态、强辐射、低真空度、高加速度等主要特性及其综合性的影响作用，搭载前进行了总体规划，统筹安排，精心设计实验研究内容。同时，根据目前条件认真设计多项不同性质的地面生物学效应模拟研究，分别进行了多种地面模拟比较性的诱变育种进行试验，以探清不同单独因子和复合因子的诱变作用规律。
　　首先，为配合本次搭载试验，根据飞船的空间环境特性和实际试验条件，搭载前根据"神舟"四号飞船的具体搭载要求，将该放线菌孢子和菌丝体以亚硝基胍的诱变作用，分别开展常规和高速度下飞行的多次诱变育种试验。结果发现诱变处理后菌落的形态变异等特征与产酶能力相关，经初筛和复筛的菌种驯化选育，进行前期性的地面模拟探索比较，获得了不少具优异性能的突变菌株，酶活都得到了明显提高与性能强化，积累了有益经验，为空间育种试验实施创造了条件。
　　同时，针对空间环境下各种粒子流、射线长期的辐射冲击等特性及其综合性的影响作用，主要采用以紫外线、60Co产生的γ射线对产MTG生产菌株进行单独照射和复合照射的诱变处理，继续开展地面生物学效应模拟分析。接着，同样采用模拟低真空度的各种试验条件，对产MTG生产菌株进行不同时间的处理，并依据本研究中所开创的针对该酶特性设计的初筛和复筛方法选育优良菌种。实验同样也选育得到了MTG生产能力得到明显提高的优良突变菌株，也为飞船搭载菌种返回优良菌株比较分析提供便利。目前正积极准备开展模仿空间微重力状态特定环境的实验条件，以便更好、全面地分析、了解空间突变作用机理，实现定向诱变育种和扩大诱变选育效果。
　　此次通过"神舟"四号飞船的搭载机会，在我国开创性地开展了一项利用国内目前最先端的空间科学技术进行新的有用微生物菌种诱变选育的有意义尝试，所设计的多项MTG生产菌株搭载诱变育种试验合理有益。研究结果表明，我国获取TG生产能力等多项性能指标达到国际先进水平，有6株选育出的搭载突变株的酶生产力明显高出于迄今为止国内外报到最高产酶水准，比对照提高了40％，空间诱变育种试验效果十分显著。有关搭载前后TG基因及启动、调节基因的碱基序列变化目前正加紧进行分析比较。
　　目前，通过实施国家科技攻关项目，结合我研究院的总体实力和充分发挥我院长期以来在微生物酶制剂发酵生产方面积累的丰富经验，根据以往的科研技术经验和所建立的MTG生产菌种的规范化分离-分析方法和优化改良工作方案，在MTG实际发酵生产和酶制剂产品分离提纯研究取得一系列成果、高质量顺利完成课题任务的同时，将经过"神舟"四号飞船搭载的MTG空间育种高产菌株进行系统性分离纯化与MTG生产性能等各种微生物学和生物化学分析总结，实现自主知识产权的创新发展，并将各种高效优良性能推向市场，进行项目科研成果的工程化技术转让。