组织匀浆的制备

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组织匀浆的制备

        1、取组织块（0.2~1g）最少可到2~5mg在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入5或10ml的小烧杯内。

        2、用移液管量取预冷的匀浆介质（pH7.4，0.01mol/L Tris-HCl，0.0001mol/L EDTA-2Na，0.01mol/L 蔗糖0.8%的氯化钠溶液）或者用0.86%冷生理盐水，匀浆介质或者生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍，用移液管或移液器取总量2/3的匀浆介质或生理盐水于烧杯中，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天热时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织的小烧杯放入冰水中）。

        3、匀浆的方式有多种：手工匀浆，机器匀浆，超声粉碎，反复冻融。

        ①手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或冷生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6~8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。

        ②机器匀浆：用组织捣碎机10000~15000r/min上下研磨制成10%组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机设备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3~5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

        ③超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用400安培，5秒/次，间隙10秒反复3~5次。

        ④反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上①②③的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。

        ⑤取少量组织匀浆作涂片（直接涂片、染色均可以），显微镜下观察细胞是否磨破，若没有破则可延长匀浆时间或增加冻溶次数（此步可省略）。

        4、将制备好的10%匀浆用普通离心机或低温低速离心机2000r/min左右离心10~15分钟，若检测ATP酶，则只需要1000转/分，离心5分钟，将离心好的匀浆留上清弃下面沉淀。

        根据你的实验需要，取适量上清液进行各种测定。