工业发酵的方式

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工业发酵的方式

　　微生物发酵是一个错纵复杂的过程，尤其是大规模工业发酵，要达到预定目标，更是需要采用和研究开发各式各样的发酵技术，发酵的方式就是最重要的发酵技术之一。通常按发酵中某一方面的情况，人为地分类为如下几种方式：

　　实际上微生物工业生产中，都是各种发酵方式结合进行的，选择哪些方式结合起来进行发酵，取决于菌种特性、原料特点、产物特色、设备状况、技术可行性、成本核算等。现代发酵工业大多数是好氧、液体、深层、分批、游离、单一纯种发酵方式结合进行的，上一节中所述发酵特征和大多数生物反应器都是这一发酵方式的体现，图15-1所示的发酵基本过程也更能全面地代表此结合方式的发酵工艺全过程，其优越性是：
　　(1)好氧单一纯种微生物产生单一产品，是现代发酵工业的主流，而此发酵方式的结合是目前相适应最多和最好的发酵方式，对大多数发酵工业是最佳的选择；
　　(2)液体悬浮状态是很多微生物的最适宜的生长环境，菌体、营养物、产物、热量容易扩散和均质，使产品较易达到高产、优质，发酵中液体输送方便，检测、控制和操作也容易实现自动化；
　　(3)深层、游离状态扩大了菌种与发酵基质的接触面，增加了发酵反应的效率，加快了反应周期；
　　(4)分批发酵对生物反应器中的发酵是间歇式操作，其主要特征是所有工艺变量都随时间而变，工艺变量主要是菌体、营养物、pH、热量、产物的变更，变化的规律性强，比较容易控制逐级放大和扩大生产规模；
　　(5)分批单一纯种的发酵，不易污染，菌种较容易复壮和改良。这些优势不是绝对的，也不是对所有微生物都适用，对某一种菌种来说，也可能变更其中一种或几种发酵方式，发酵会更好，结果更佳，效益更好，因此，其它发酵方式都应积极研究、开发和应用。

一、连续发酵
　　连续发酵(continuous fermentation)是相对于分批发酵(batch fermentation)而言的，也是连续培养技术在发酵工业上的应用，就是连续培养放大后用来大规模生产微生物的产品。连续发酵的方式和生物反应器类型也是各式各样，主要是具有菌体再循环或不循环的单罐(级)连续发酵(图15-8a)和具有菌体再循环或不循环的多罐(级)连续发酵(图15-8b)。

　

图15-8　两种连续发酵方式示意图

　　连续发酵的主要优势是简化了菌种的扩大培养，发酵罐的多次灭菌、清洗、出料，缩短了发酵周期，提高了设备利用率，降低了人力、物力的消耗，增加了生产效率，使产品更具商业性竞争力。例如：面包酵母连续发酵生产与用分批发酵生产相比，其生产效率较高，而成本较低，如表15-5所示。又如：丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)采用两罐(级)连续发酵生产丙酮丁醇。第一罐培养液的稀释液为0.125/小时，即流速控制成8小时更换一次罐内的培养液，发酵温度37℃，pH4.3。此罐主要产菌体，第二罐稀释率为0.04/小时，即25小时更换罐内培养液一次，33℃，pH4.3发酵。这样连续发酵大规模生产丙酮、丁醇溶剂，连续运转一年多，比分批发酵的效益高得多。

表15-5　连续发酵与分批发酵生产面包酵母的比较

面包酵母的生产	分批发酵	连续发酵
168小时最大产量(吨)	225	300
7天生产酵母(吨/1000加仑)	1.5	2.5
平均每小时生产酵母(吨)	1.34	1.78
每吨酵母耗工时	7.0	3.8
每吨酵母耗电(度/吨)	500	430

　　
连续发酵已被用来大规模生产酒精、丙酮、丁醇、乳酸、食用酵母、饲料酵母、单细胞蛋白、浮游生物的生物量和石油脱蜡及污水处理，并取得好效果。但对大部分微生物来说，进行连续培养研究其生理、生化和遗传特性，是不困难的，连续培养技术发挥了重要作用，获得了很多研究成果，但用连续发酵进行大规模生产还是困难的。主要原因是连续发酵运转时间长，菌种多退化，容易污染，培养基的利用率一般低于分批发酵。而且工艺中的变量较分批发酵复杂，较难控制和扩大。尤其是在次生代谢产物，如抗生素大规模工业生产中，难以实现连续发酵，因生成次生代谢产物所需的最佳条件，往往与其产生菌种生长所需的最佳条件不一致，有的还与微生物细胞分化有关，现代发酵工业中又多使用高浓度营养组分，这些都是连续发酵急待解决的难题。连续发酵推广应用中所遇到的困难和问题，随着对该技术的深入研究、改进，尤其是与各项高、新技术密切结合，相信将日趋完善，有着广阔的应用发展前景，发挥更大的效益。

二、固定化酶和固定化细胞发酵

　　微生物也可以看作是多种酶的包裹，工业发酵是合理控制和利用微生物酶的过程，因此，可以将酶从微生物细胞中提取出，将其与底物作用制造产品，也可以将提取出的酶用固体支持物(称为载体)固定，使其成为不溶于水或不易散失和可多次使用的生物催化剂，利用它与底物作用制造产品。同样可以将微生物细胞用载体固定，将反应物与其作用，制造产品或做其他用途。未固定的酶或细胞用于工业生产，可以称为游离酶或细胞，固定的酶称为固定化酶 (immobilized enzyme)，固定的微生物细胞称为固定化细胞(immobilized cell)。固定化酶(细胞)用于发酵可称为固定化酶(细胞)发酵，或简称固定化发酵。

　　1.固定化的优势　
　　(1)固定化酶和固定化细胞可以重复使用。
　　游离酶(细胞)与底物作用是一次性的，非连续性的发酵罐发酵也是一次性的，而固定化酶和固定化细胞与反应物作用可多次使用，有的可达几十、几百次，甚至连续使用几年，尤其是固定化细胞，可以看作是固定化细胞的连续发酵，极大地提高了生产效率，如用固定化梭状芽胞杆菌厌氧条件下连续发酵生产正丁醇和异丙醇，已获得产率较分批发酵高4倍。
　　(2)固定化酶和固定化细胞产品的分离、提纯等后处理比较容易。
　　游离酶与产品混在一起难分离，发酵罐的产品与大量的菌体和非需要的产物混在一起分离、纯化难度也较大，固定化酶和细胞的产品相对地比较少地含有非需要产物和菌体。
　　(3)固定化酶和固定化细胞一般都做成了球形颗粒或薄片状，使产品的生产工艺操作简化，易于机械化和自动化，设备和器材也较简易。
　　(4)固定化酶和固定化细胞可以制成酶活力很高或细胞密度很大，而且抗酸、碱、温度变化的性能高，酶活力较稳定。
　　因而反应速度加快，生产周期缩短。
　　(5)固定化酶与固定化细胞相比，各有所长。
　　固定化酶相对产物更单一，非需要的产物更少些，生产操作条件更易控制，而固定化细胞不需要酶的提取，减少了酶活力的损失和操作，还可以利用细胞中的多酶体系，完成需要多种酶参加的反应，而且固定的微生物细胞可以是死的，也可以是活的，后者并可增殖，更有利于重复使用和加快反应速度，许多固定化微生物活细胞，用来处理某些污水的工艺，一直运转几年，固定化细胞仍可使用。

　　2.固定化的几种类型　
　　用不同的载体和不同的操作方法将酶或微生物细胞固定，根据固定化的主要机理，一般分成4类。
　　(1)吸附固定化
　　按照正、负电荷相吸的原理，酶或细胞吸附在载体的表面而被固定(图15-9a)。例如，用瓷碎片、玻璃球、尼龙网、棉花、木屑、毛发等做载体，经一定操作处理后，将酶或细胞可吸附固定在其表面。
　　(2)包埋固定化
　　大分子的有机或无机聚合物，将酶或细胞包裹、载留在凝胶中而被固定(图15-9b)。例如：可用琼脂、明胶、海藻酸钙、k-角叉菜聚糖、聚丙烯酰胺等做载体，经一定的操作处理后，将酶或细胞包埋在里面。
　　(3)共价固定化
　　酶或细胞与载体通过共价键而被固定(图15-9c)。例如：酶或细胞溶液与含羧酸载体(R-COOH)或氨基载体(R-NH[sub]2[/sub])，在缩合剂碳化二亚胺作用下，经搅拌等处理，而制成固定化酶或细胞。
　　(4)交联固定化
　　采用酶分子或细胞上的化合物基团之间在双功能基团交联剂作用下，与载体上的化合基团相互交联呈网状结构而被固定( 图15-9d)，最常用的交联剂是戊二醛。
　　(5)微囊固定化
　　用一层亲水性的半透膜将酶或细胞固定在珠状的微囊里(图15-9e)。例如：用海藻酸钠溶液与酶或细胞混合，滴入CaCl2溶液中形成凝胶微珠，然后用聚赖氨酸溶液处理微珠表面，再用柠檬酸去除海藻钙微珠的钙离子，使微珠内海藻酸成液态，酶或细胞悬浮其中，而微珠表面由于受到聚赖氨酸的处理，钙不被去掉，从而不再溶解，形成一层微囊膜，酶或细胞包在微囊中而被固定。有的固定化的机理既有吸附原理，也有包埋作用或化合键的形成，即固定化酶或细胞是根据多种原理而制成的。

　

图15-9　固定化类型的原理示意图

　

　　3.固定化的应用和存在的问题　
　　固定化技术在微生物工业方面的应用，经以往20多年的研究开发，其优势越来越强，采用面越来越广。固定化酶由于研究开发较早，而且较易控制，比固定化细胞的应用目前更为广泛和深入。表15-6是固定化细胞的应用实例。固定化发酵应用领域有饮料、医药、化工、能源、环保等，而且还在不断拓宽应用范围和改进固定化技术，特别是该技术存在的一些问题，较严重地影响它的发展。
　　存在的问题主要有：
　　(1)需要好氧反应的固定化，固定化细胞的壁和膜，所造成底物或产物的进、出的障碍和载体造成的通气困难，往往严重影响反应速率，产量低下。
　　(2)有的容易细胞自溶或污染，或固定化颗粒机械强度差，或酶、细胞容易从载体脱落，或酶、细胞的活性很快被抑制，使反复利用次数少，产品质量和数量不稳定。
　　(3)固定化酶和固定化细胞反应动力学及其有关机理、专用设备研究缺乏，也阻碍了该技术的应用。存在的问题，随着深入的研究开发，特别是加强分子生物学技术的手段，新材料的采用，先进化工工程的借鉴，计算机的利用，将会较快解决，将给微生物工业带来巨大的变革。我国固定化细胞发酵生产酒精和啤酒都已取得了很好的经济效益。

　表15-6　固定化细胞的应用实例

被固定的微生物细胞	所用载体和方法	底　　物	产物或用途
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)	硅和聚氧乙稀碎片，吸附	葡萄糖	乙醇
酿酒酵母	魔芋葡甘露糖，共价	葡萄糖	乙醇
酿酒酵母	海藻酸钙，包埋	麦芽汁	啤酒
委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)	明胶，微囊	葡萄糖	果糖
黑曲霉(Aspergilus niger)	甲基丙烯酸缩水甘油脂聚合物戊二醛交联	葡萄糖	葡萄糖酸
芽孢杆菌(Bucillus sp.)	聚丙烯酰胺，包埋	蛋白胨等	杆菌肽
粘质赛氏菌(Serratia marcescens)	卡拉胶，包埋	明胶，蛋白胨等	碱性蛋白酶
珊瑚诺卡氏菌(Nocardia corallina)	酚醛树脂，吸附	丙烯腈废水	处理废水
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)	明胶，包埋	葡萄糖	血糖检测传感器
木醋杆菌(Acetobactes xylinum)	卡拉胶，包埋	乙醇	酒精检测传感器
柱孢鱼腥蓝细菌(Anabaena cylindrica)	玻璃珠，吸附	光解水	链鱼腥蓝细菌(Anabaena azollae)
链鱼腥蓝细菌(Anabaena azollae)	海藻酸聚赖氨酸，微囊	N[sub]2[/sub]	固 氮
荨麻青霉(Penicillium urticae)	角叉菜聚糖，包埋	葡萄糖，酵母提取物	棒曲霉素
丙酸细菌(Propionibacterium sp.)	光交联树脂，包埋	硫酸钴、甘氨酸 等	B12
谷氮酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)	聚丙烯酰胺，包埋	葡萄糖等	L-谷氨酸

三、固态发酵

　　固态发酵(Solid State fermentation)又称固体发酵，是指微生物在没有或几乎没有游离水的固态的湿培养基上的发酵过程。固态的湿培养基一般含水量在50%左右，而无游离水流出，此培养基通常是"手握成团，落地能散"，所以此发酵也可称为半固体发酵。培养基呈液态的微生物发酵过程称为液态发酵。我国农村的堆肥、青饲料发酵和做酒曲，就是固态发酵。固态发酵工艺历史悠久，在现代微生物工业中应用较少。表15-7是固态发酵生产的一些产品。

　表15-7　固态发酵生产的实例

菌　种	固态培养基的主要基质	产　 　品
地衣芽孢杆菌(Bacillus Lichemiformis)	麸皮、谷糠、豆饼粉	蛋白酶
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiemisis)	肥土、麸皮、豆饼粉、硫酸 铵	Bt杀虫剂
白僵菌(Beauveria bassiana)	麸皮、谷壳、玉米芯粉	白僵菌杀虫剂
细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)	棉饼粉、肥土、蔗糖	抗生菌肥 料
圆生蘑菇(Agaricus hortensis)	秸杆、粪、棉子壳、碳	蘑菇
香菇(Lentinus edodes)	木材，秸杆	香菇
米曲霉(Aspergillu oryza)	谷物，麸皮，秸杆	淀粉酶
黑曲霉(A. niger)	麸皮，米糠，豆饼粉	有机酸
硫杆菌(Thiobacillus sp.)	低品位矿石	金属浸出
腐乳毛霉(Mucor sufu)	大豆制品	豆腐乳
产朊假丝酵母(Candida utilis)	甘蔗渣，甜菜渣	单细胞蛋白

　

　　厌氧菌固态发酵生产较简易，一般采用窖池堆积，压紧密封进行。好氧菌的固态发酵生产可以将接种后的培养基摊开铺在容器表面，静置发酵，也可通气和、或翻动，使能迅速获得氧和散去发酵产生的热，因通气、翻动、设备条件、发酵菌种和产物等的不同。固态发酵的反应器和培养室也是多种多样，如图15-10所示。

　

图15-10　几种固态发酵反应器和培养室

　固态发酵的特征，体现在它与液态发酵相比的相对优、缺点方面(表15-8)。微生物工业的生产是选择固态发酵工艺还是液态发酵工艺? 取决于所用菌种、原料、设备、所需产品、技术等，比较两种工艺中那种可行性和经济效益高，则采用那一种。现代微生物工业大多数都是采用液态发酵，这是因为液态发酵适用面广，能精确地调控，总的效率高，并易于机械化和自动化。

　表15-8　固态发酵与液态发酵相比的优、缺点

优　　点	缺　　点
1.培养基含水量少，废水废渣少，环境污 染少，容易处理。	1.菌种限于耐低水活性(aw)的微生物，菌种选择性少。
2.能源消耗量低，供能设备简易。	2.发酵速度慢，周期较长。
3.培养基原料多为天然基质或废渣，广泛易得，价格低廉。	3.天然原料成分复杂，有时变化，影响发酵产物的质和量。
4.设备和技术较简易，较低的投资。	4.工艺参数难测准和控制。
5.产物浓度较高，后处理较方便。	5.产品少，工艺操作消耗劳力多，强度大。

　随着机械化、自动化、化工工程、技术和设备的发展，尤其是电子技术、计算机产业的飞速进展，这些先进的技术和设备在固态发酵中的应用，使固态发酵的劣势逐步化解，而优势更显突出，使古老的工艺焕发青春，在生物工业中的作用和地位逐步提高，使某些发酵产品的生产用固态发酵将比液态发酵更好。

四、混合培养物发酵

　　混合培养物发酵(mixed culture fermentation)，又简称混合发酵，它是指多种微生物混合在一起共用一种培养基进行发酵，也称为混合培养。用纯的单一菌种的发酵可称为纯种发酵，或纯培养。混合发酵也是由来已久，许多传统的微生物工业就是混合发酵，如：酒曲的制作，某些葡萄酒、白酒的酿制，湿法冶金，污水处理，沼气池的发酵等都是混合发酵。这些混合发酵中菌种的种类和数量大都是未知的，人们主要是通过培养基组成和发酵条件来控制，达到生产目的。随着对微生物群落结构的相互作用认识的发展，对混合发酵技术研究和开发的深入，采用已鉴定的两种以上分离纯化的微生物作为菌种，共用同种培养基进行发酵，也有人将此称为限定混合培养物发酵(defined mixed culture fesmentatien)。
　　混合发酵有三个突出优势：
　　(1)充分利用培养基、设备、人员和时间，可以在共同的发酵容器中经过同一工艺过程，提高所需产品的质和量，或获得二种、或多种产品。即可做到三少一多：生产人员少，原材料和能源消耗少，设备和器材少，而生产的产品的效益高或种类多。例如：产黄纤维单胞菌(Collulomonas flavigena)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)利用纸浆纤维作唯一碳源混合发酵，生产5′-单核酸和单细胞蛋白。发酵中，产黄纤维单胞菌生长产酸使pH降至6以下时，则自身停止生长，而恶臭假单胞菌利用产黄纤维单胞菌发酵中产生的可溶性糖生长，能把pH维持在6.5～7.0，这样两种菌互惠，使得能继续生长，纤维素迅速分解，而获得高产的两种产品。我国创新的维生素C二步发酵法，其特别为第二步发酵由氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconabacterium oxydonas)和巨大芽孢杆菌等伴生菌混合发酸完全。该发酵技术已在多国申请了专利，并成功地成为我国向国外转让的第一个生物高新技术，国内厂家也都采用了此技术，取得了很大的经济效益。
　　(2)混合发酵能够获得一些独特的产品，而纯种发酵是很难做到的。例如国内外享有盛誉的茅台酒，就是众多的微生物混合发酵的产品，据气相色谱和质谱分析，它含有各种醇类、酯类、有机酸、缩醛等几十种化合物，其风味优异而独特，目前还不可能将茅台酒制作的混合微生物一株株分离，纯培养，分别发酵再将发酵产物配制成茅台酒。现代微生物发酵产品如果要实现混合发酵生产，需要对所有菌株特性深入研究，利用它们的互利关系，使所用混合菌种取长补短，发挥各自的优势，生产出成本低、质量优的产品或多种产品。
　　(3)混合的多种菌种，增加了发酵中许多基因的功能，通过不同代谢能力的组合，完成单个菌种难以完成的复杂代谢作用，可以代替某些基因重组工程菌来进行复杂的多种代谢反应，或促进生长代谢，提高生产效率。例如：华根霉(Rhizopus chinensis)可发酵生产延胡索酸。当它与大肠埃希氏菌(E.coli)混合发酵，延胡索酸就能完全转化成琥珀酸。用膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)代替大肠杆菌混合发酵，延胡索酸就被转化为L-苹果酸。如果普通变形菌(Proteus vulgaris)和少根根霉(R.arrhizus)混合发酵，则可将延胡索酸转化为在天冬氨酸。

白云

学习！

草稚剑

学习