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[分子诊断] 关于PCR假阴性问题总结

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发表于 2013-9-23 19:52:29 | 显示全部楼层 |阅读模式

PCR的假阳性问题深受重视,但我个人认为PCR假阴性问题相对于临床检测更为严重。其实PCR假阳性的问题是比较单纯的,一般仅涉及污染和引物的非特异性问题。而污染可以通过严格的实验室管理,合理的环境设置,以及加入UNG酶抗污染基本可以解决,而引物的非特异性问题基本属于厂家试剂质量问题。而PCR的假阴性却不同,它涉及了与PCR实验的几乎所有人员和技术环节,十分复杂。就临床而言,大三阳检出率低、甚至于GC镜下都很多时,PCR
仍为阴性的事情也经常发生,可见假阴性问题的严重性。

  就PCR假阴性问题总体来说有如下因素:
  一. 仪器因素
  PCR实验对仪器的依赖性是很高的,离心机、扩增仪都是造成PCR假阴性的因素。扩增仪的主要问题是孔间差,引起扩增失败可扩增效率降低。而离心机的影响则更容易被忽视。国内使用离心机很少使用离心加速度(XXXg)作为参数指标,而常使用转数作为参数指标,这里就存在着一个问题,由于离心机的大小不同,有效跳心半径也不相同,因此同样的转速所产生的离心力相差很大(有的在数倍以上),所以在相同的离心时间下,有可能模板并没有离心下来,造成PCR假阴性。这个问题在其他实验也有,但因基他实验都是测定大分子蛋白沉淀,对离心的速度要求较低所以不太明显。建议使用小型台式离心机的实验要注意一下这个问题。
  二. 试剂质量问题
  PCR实验的成功与否试剂的质量至关重要,试剂的质量问题涉及多个方面:细胞的裂解;模板的抽提;引物位点的选择;Taq酶的活性等等。其中任一环节出了问题都会引起结果的假阴性。这些都是试剂质量的问题,因此选用高质量的PCR试剂非常重要。
  三. 核酸模板问题
  核酸模板质量问题是制约PCR最重要的因素之一。核酸模板在扩增区出现断裂、蛋白粘附、空间位阻等模板质量问题都有可能引起扩增失败造成结果的假阴性或定量不准确。由于无论什么提取方法都不可能得到完全理想化的核酸模板,因此核酸模板质量虽然与试剂的质量有关,但它不可能由试剂质量完全解决。
  核酸模板问题除了模板本身的问题外,还存在模板溶液中抑制Taq酶活性成分(如某些蛋白、离子等)作用,而导致扩增效率降低甚至扩增失败的问题。对此,有人提倡进行模板纯化,效果较为明显。但另一个问题又出现了,那就是怎样保证纯化的回收率问题。总之,核酸模板问题是不可避免的问题,只能努力去减少。
  四. 操作人员素质问题
  PCR实验的环节很多,而且对每一环节的质量要求都很高,例如少加、漏加试剂、离心不充分、循环参数设计错误、对于RNA抽提降解、逆转录失败等等都能造成结果的假阴性。因此要求PCR的实验操作人员有很好的素质,能够严格遵守操作规程,并能敏锐的发现问题和解决问题。
  五. 其他
  PCR实验中从样品的采集、运输、保存开始就可以引起结果的假阴性,而对于病原体检测(如HBV)在人体血液系统出现有周期性变化也是值得注意的因素。

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 楼主| 发表于 2013-9-23 19:59:25 | 显示全部楼层
实验室大片段核酸PCR时的注意要点

在实验室使用PCR仪进行PCR时,遇到3-5kb以上的大片段DNA时,许多同学的扩增结果往往出现假阴性,条带模糊等不理想的情况。那么对于大片段的DNA进行PCR时要注意哪些?怎样才能得到理想的结果呢?
主要从以下方面入手更正:
1,确定反应体系各组分的量是否足够(如引物量、模板量,镁离子量等);
2,确定延伸时间是否足够,计算适当增加延伸时间(延伸时间要足够长,一般按1min/kb延伸。);
3,确定退火温度是否合适,适当降低退火温度;
4,确定所使用的酶是否合适,可试试Takara的LA Taq等;
5,适当提高反应体系的pH值,反应初始pH应控制在pH8.8-9.2范围内;
6,尽量缩短升温、降温过程,尽可能选择导热性优良的薄壁反应管;
其中对于酶的选择较为关键:对于大于4kb的PCR,建议使用长片段PCRTaq(如TAKARA公司的LA-Taq,MBI公司的long PCR Enzyme Mix等)。引物是则是另一个重要的因素:引物长度最好在20~25bp之间,Tm在60度左右,可Primer premier5.0等软件设计,两条引物Tm不应相差超过4摄氏度。
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