关于诱变育种的方法

宏图

一．诱变
1.制备菌悬液
取培养7天的斜面菌种一支，加入5 ml无菌水，用竹签轻轻将斜面表面的孢子刮下，倒入已灭菌的50 ml三角瓶中，瓶中预先放置数粒玻璃球，充分振荡后用无菌擦镜纸过滤，滤液适当稀释，调整孢子数位1×10[sup]8[/sup]个/ml。
2.紫外诱变
将菌悬液和无菌转子倾入90 mm无菌培养皿，再将无菌培养皿置于磁力搅拌器上，在暗室于15 W 紫外灯下10 cm处开盖，边搅拌边照射，分别照射0 s，10 s，20 s，30 s，40 s，50 s，60 s。将照射后的种子悬液稀释到合适的倍数，涂布于固体平板上培养3 d，以固体平板上长出的单菌落（CFU）个数，计算不同诱变剂量的致死率。 （照射距离和时间你可以参考一下前人做的实验，初次计算致死率的话，时间间隔可以稍微大一点）

致死率=（（U-T）/U）×100%

式中，U为未经紫外照射处理的种子液在固体平板上长出的CFU总数；T为诱变处理后的种子液在固体平板上长出的CFU总数。


3. 氯化锂(LiCl)诱变
取孢子悬浮液分别于等体积的氯化锂溶液(LiC1)中，充分混匀，静置诱变20 min，其中氯化锂溶液浓度分别为0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%。取诱变后的菌液0.1 ml涂布与孢子培养平板中，菌落计数并计算死亡率，选取合适的处理剂量。
4.复合诱变
用最佳的紫外照射时间和最佳诱变浓度的LiC1诱变，将诱变后的孢子液接入48孔板中，尽量将所有诱变液全部接完，进行培养，并将剩余种子液封好封口膜，立即保存在4℃冰箱，以便后续高产菌株的反馈跟踪。
5. NTG诱变
NTG溶液的制备
称取10mg NTG于Eppendor蹭中，加入lmL丙酮充分溶解，配制成10mg／mL的NTG母液。 NTG诱变采用浓度为1mg／mL和2mg／mL的NTG溶液对孢子悬浮液进行诱变处理。各取900微升和800微升萌发好的孢子悬浮液于Eppendo管中，再分别加入100微升和200微升NTG母液，混匀，使诱变浓度分别为lmg／mL和2mg／mL。将孢子悬液分别处理10、20、30、40、50min，2500r／min离心10min收集孢子，无菌水重复洗涤3次后，取1 00微升孢子悬浮液稀释涂平板，每个梯度设置3个重复，29℃培养7d。含NTG的废液，倒入饱和Na[sub]2[/sub]S[sub]2[/sub]O[sub]3[/sub]废液缸中，反应12h以上后进行常规处理。
6. ARTP诱变
6.1  制备菌悬液
按照上面的方法制备。
6.2  金属载片的处理
移液枪吸取10 μL菌悬液，点在已高温灭菌的金属载片（金属载片也可浸泡在酒精内，取出在酒精灯上灼烧30 s以上，无菌环境下自然冷却）上。如果菌悬液集中在金属载片上的中心位置或者分布不均匀，可使用移液枪无菌枪头涂抹，使之在金属载片上分布均匀，然后再将金属载片置于超净台上吹至湿润状态。完成后，使用无菌镊子将金属载片转移至无菌平皿中待用。
6.3  辐射处理启动ARTP诱变系统，调整和检查各项诱变参数。实验前，先用75% 酒精和紫外线对操作平台进行灭菌处理，紫外杀菌时间30 min。ARTP诱变系统参数主要为功率、辐照距离、气流量、辐射时间。通过设定一定的功率，一定的气流量，一定的辐照距离，调整不同的时间，绘制致死率曲线确定最佳辐照时间。本研究利用高纯氦气作为工作气源，在表所示的ARTP操作条件下，发射的等离子温度在20 °C-40 °C。为了确定最佳诱变剂量，首先要绘制致死率曲线。辐射时间分别为0 s、15 s、30 s、45 s、60 s，然后将处理后的样品稀释到合适的倍数，涂布于固体平板上37 °C恒温培养3 d，以CFU方法计算致死率。每次辐照一个金属载片，用无菌镊子将平皿内的金属载片转移到载物台上，转动载物台使金属载片置于离子发射器发射口正下方，调整升降支架高度至预定位置，设定好辐照时间后进行诱变处理。菌液处理完成后，将处理后的金属载片转移至装有1 mL无菌盐水的2 mL无菌EP管中，置于振荡器上振荡1-3 min，把附着在金属载片上的菌体洗脱掉，形成新的菌悬液。

宏图

自己的帖子顶啊顶

dengjian2016

顶，很详细，我想问下ARTP诱变效果怎么样？