细胞培养过程参数演变史

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[paragraph]哺乳动物细胞分批培养工艺被广泛的应用于生产治疗性重组蛋白，该工艺具有操作简单、稳定性好、灵活性强和产量高的特点。许多参数可以实现实时监测和控制，例如转速、pH、溶氧。一些离线参数例如活细胞数量、渗透压，代谢产物像葡萄糖乳酸可以通过人工取样，离线检验获取。通过补料或者灌流的方式可以不断的更新培养基的各种营养成分，补料策略（补料培养基的组成、补料数量、补料时机）的优化一般是根据细胞的生长、营养物质的消耗（氨基酸、葡萄糖浓度），副产物的积累（乳酸和铵离子）以增加表达量、维持细胞高活力和生产专一性强的产品、延长培养周期。
在这些方法中，通常需要减少乳酸和氨的积累以减轻对细胞生理学的任何潜在负面影响。在培养基中维持低水平的葡萄糖和/或谷氨酰胺是最常用的策略之一，因为实施相对简单并且能够控制Ph的回升，以限制葡萄糖的运输，从而有效抑制CHO分批培养中的乳酸积累。此外，生物量通常用于确定细胞培养过程中的营养物质的补料水平，因为它与细胞的生理和代谢状态以及治疗性蛋白质的生产能力密切相关.Huangetal（2010）和Yu等人（2011）分别报告了在分批-补料培养工艺中利用优化培养基和基于生物量的动态补料策略，可以使细胞的表达水平达到10g /L。但是，由于这些参数不是实时监控的，基于反馈的开发受到离线采样频率的限制。此外，通过人工取样对这些培养物进行离线监测往往是劳动密集型的，并且会在操作过程中引入操作误差。在目前的工业细胞培养生产过程中，DO，pH和温度等关键参数已经完全实现在线控制，因此将在线控制扩展到补料过程控制中减少操作误差是未来细胞培养技术发展的必须趋势。
在过去的十年中，开发了各种过程分析技术（PAT）（FDA，2004），以便在培养哺乳动物细胞的过程中以快速而有效的方式监测代谢物和VCD。Larson等人（2002）报道使用能够测量氨基酸和碳水化合物的在线高效液相色谱（HPLC）系统来研究哺乳动物细胞培养中的代谢产物。此外，NOVAFLEX在线自动采样系统（由自动采样系统和生化分析仪组成）能够自动检测培养基浓度和代谢产物积累，并且按照设定的值进行自动补料（Derfus等，2010）。然而，由于取样量较大导致实验室规模的取样频率有限，限制了其在所有工艺中的应用。赛多利斯也推出了类似的PAT分析工具，也是一个实时监测系统，与nova最大的不同在于取样的体积更小，因此可用于高频监测葡萄糖浓度，控制乳酸的积累。
除此之外还开发了许多其他技术来实时监测细胞培养过程中的VCD，比如细胞光密度、活细胞电容探头、近红外光、拉曼光谱学、原位显微镜、声学共振密度等和基于软传感器的方法（Abu-Absi等，2010;Bittner等，1998;Crowley 2005; Dorresteijn等，1996;Finn等，2006;Guez等，2004;Harris等，1987;Lu等，2013;Wu等，1995）。在这些方法中，活细胞电容电极是最可靠的方法之一，因为其他方法可能难以区分活细胞和死细胞。电容传感器可以实时检测培养基电容常数，从而实现快速、简单且高效的过程监测和控制。另外，Braasch等人（2013）开发了一种新型装置——介电泳（DEP）细胞计数器，它为早期检测细胞凋亡提供了潜在的可能，因此可以通过预测细胞凋亡的时间，从而及时调整补料策略。
我们从过程控制的角度出发，展示过程控制策略在细胞培养中的重要作用，在本文中，我们介绍了先进的过程控制策略，以展示细胞培养代谢物的全自动在线监测系统，以及与计算机控制相结合的自动闭环控制系统，来实现对细胞培养过程中关键参数的直接检测和间接计算，以改善补料分批细胞培养过程的生产的效率和质量。
根据我们过去的经验（Tsang等人，ACS国家会议2008），某些代谢物可以作为其他不容易测量的代谢物（氨基酸，维生素等）的替代指标。在我们的第一项研究中，我们阐明了基于谷氨酸水平的监测和自动反馈控制可以动态调整细胞培养过程中的补料量并提高产量。据我们所知，这是首次报道的补料分批过程，利用在线氨基酸测量触发自动反馈控制，提供全自动的补料策略。
此外，相对于手动控制的补料策略，全自动化的闭环补料系统对产品质量的稳定性基本上没有影响。在第二项研究中，我们应用了两个相对独立的在线过程检测指标：活细胞数量（在线活细胞电极）、葡萄糖浓度（西尔曼科技M900生化分析仪配合自动取样系统），开发了一个真正的自动闭环控制系统。在这个自动闭环补料系统中我们利用该生物电容(BC)探针来确定复杂的补料培养基的补料量，同时利用生化分析来确定葡萄糖定的补料量。我们利用低接种密度来模拟细胞的低水平生长，结果表明自动闭环控制系统可以提高细胞培养的稳定性。最后，我们还展示了基于乳酸-葡萄糖补料策略能够显著增加单克隆抗体产量。与先前基于pH的补料策略相比（Gragnon等，2011），使用在线生化分析仪能够更准确，快速地测量和控制葡萄糖和乳酸水平，由于培养基中缓冲体系的存在可能会延迟细胞代谢废物乳酸对ph变化的真实影响，往往导致乳酸大量积累以后，ph才开始变化。






本报告根据在线监测项目的不同实施了三种不同的自动反馈控制策略详见表（1）。结果表明使用基于谷氨酸或葡萄糖/乳酸盐的反馈控制来减少代谢物废物积累，有效提高了VCD、延长了细胞培养时间，从而导致抗体产量显着增加。另外由于补料量是根据工艺变化实时自动调整，有效避免了手动补料导致的营养物质过多或者不足引起细胞密度的变化。

本报告还介绍了葡萄糖/乳酸在线分析仪在更高采样频率下对细胞培养过程控制的成功应用。总之，这些策略构成了开发下一代细胞培养生产工艺的工具箱，可以利用营养和代谢物水平的自动化，实时控制。


文章来源：
AdvancedProcess Monitoring and Feedback Control to Enhance Cell CultureProcess Production and Robustness ；Biotechnologyand Bioengineering, Vol. 112, No. 12, December, 2015 DOI10.1002/bit.25684