生产菌种管理两个不可不知的核心概念及其解析（力荐）

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生产菌种管理两个不可不知的核心概念及其解析（力荐）


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[color=rgba(0, 0, 0, 0.298039)]细履平沙 发酵人社区
摘要：  当GMP延伸至原料药的质量管理体系时，意味着生产原料药的发酵，其过程的质量控制也须符合GMP要求，菌种是影响发酵产品质量最关键的因素，所以必然成了质量审核的重点。
        本文对菌种管理涉及的主菌种库（MCB)和工作菌种库（WCB)概念、生产实践中的疑问、技术指标和关键注意事项进行简述。

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01
基础概念
主菌种库（MCB )
主菌种库(master cell bank )是从PCB(preliminary cell bank)分离出来的单菌落，然后对该单菌落经过传代，增殖后混成均质菌悬液，定量分装于冻存管，并采取适当方法保存的用于制备工作菌种库的菌种来源。

工作菌种库
工作菌种库是由主菌种库再传代增殖后，混成均质菌悬液，定量分装于冻存管，并采取适当方法保存的用于商业化生产的菌种来源。

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02
存在的问题
对MCB和WCB没有明显的区别
很多企业只是纯粹把保存的菌种按照保存代次的不同而简单地认为MCB和WCB，或者把保存在一个更低温的条件（如-80 度) 的菌种库当为MCB，而故意把WCB保存在一个相对高温（如-20度）的条件缩短其保持期限，以示区别。
导致这一现象的原因是没有深入理解MCB和WCB在概念和功能上的区别：
1、来源的不同，MCB来源于初始菌株的单菌落，如诱变后的高产菌种，在经过稳定性验证后，从这一高产单菌落中进行增殖获得的一系列的菌悬液。WCB是从MCB扩增而来，但并不出自于MCB的单菌落。
2、对法规理解偏差，如果每年的使用量特别小，当MCB足以支持生产需要时，便没有必要设置WCB。
3、MCB和WCB在工艺和质量放行的标准上存在不同。一般MCB比WCB在使用和标准上更严格。
何时制备WCB
工作库发现有问题或因为保存条件的改变，应立即停止使用，重新制备工作菌种库。
• 当使用的工作库不足量时。
• 当使用的工作库保存时间即将超过保存期限时。
• 当工作菌种质量不符合放行条件时。

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03
技术指标
WCB技术指标
发酵所用的菌种除了常规的检测指标，如菌落形态外观、生产能力和其他生化指标外，还需要检测：如污染菌检査（微生物、真菌、支原体的检测分析）、组分检测、孢子量检测等。
MCB技术指标
MCB与WCB相比有更高的要求，除了WCB所要求的技术指标外，通常还需要采用保守区域的基因序列分析或基因组的限制性酶切图谱分析，以确认MCB稳定。

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04
新菌种应用问题
问题1
微生物发酵产品通常会采用化学、物理诱变方法或者基因技术对微生物菌种进行选育或基因改造，得到一个更高产能效率的新菌种，那么这一新菌种是否可以进行商业化生产呢？
答案是：得到的高产菌株，如果经过生产能力，传代稳定性，组分检测、孢子量等检测指标，尤其是杂质指纹比较后，确定没有问题后就可以建立新的主菌种库，而用于商业化生产。但是更换主菌种库，应提供相关的文件，需要事前告知客户，并按照变更注册。
问题2
在发酵生产中发现有WCB产量特别高，是否可以将其作为PCB，再制备成MCB？
答案是：问题2和问题1是一样，所以回答也相同。
在这里笔者建议在做决定之前，一定要再取出另外的WCBs进行对照，以确认不是其他因素的影响，否则更换MCB的成本确定很高。
问题3
采用基因改造技术提高产量或降低杂质得到的转基因新菌株（GMO），是否与前述的普通诱变技术得到的高产菌株使用的流程一样呢？
答案是：虽然从理论上认为中断或增加某功能基因或调节基因，并不影响其他的代谢途径，但是微生物代谢往往是一个代谢网络，人为基因的修饰会导致微生物代谢紊乱，很难确定不产生其他的杂质，这样潜在的非预期风险很大。
如在1 9 8 9年一家曰本公司生产色氨酸，为提高色氨酸的产量，插入4 个基因，从而增加了很多不同的杂质，其中产生的一种是嗜酸性红细胞过多肌痛综合征（E M S )的原因，从而导致3 7人死亡，1 5 0 0人得了伴随严重痛苦的慢性疾病，成为历史上有名的色氨酸灾难事件。
所以使用基因技术得到的微生物菌株用于生产需要非常谨慎，需要更为谨慎的检测和验证，尤其是杂质指纹比较验证并确定无毒风险，方可以使用。

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05
注意事项
1、对MCB和WCB保存的菌株进行有效的管理，比如严格的登记和双人开锁，双人复核，防止出现菌种流失或销毁失误。
原创   菌种保密是不是像防贼一样防员工？
菌种相关的技术及其基础知识
2、对MCB和WCB分开保存，尽量使用不同颜色的保存容器，防止因混淆而导致误用。
3、对菌种的保藏方法和技术要求进行必要的验证并保存好验证文件，另外定义中强调的是均质菌悬液，所以在MCB和WCB制备过程中要给予重视。
4、MCB和WCB制备时无菌环境特别重要，保险起见可以选择在洁净环境中的隔离器中完成。
5、保证MCB的安全：有双路电源，有UPS和报警，一旦保存环境出现问题，后果不堪设想！

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06
参考文献
1、百度
2、国家FDA药品认证管理中心《药品GMP指南 原料药部分》
3、ICH Guideline Q5D Quality of Biotechnological Products