细菌总数检测方法国内外发展的现状

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食品所含细菌总数是食品卫生学的微生物学重要的指标，主要作判别食品被污染程度的一个重要指标。细菌总数的检测的方法有很多种，但是国内外普遍采用需氧平板计数法（Aerobic plate count，APC），检测需 48h 才 可 报 告 准 确 结 果 。 我 国 国 家 标 准 是 应 用 营 养 琼 脂 （ 简 称NA,GB47892-94）。该法采用 37℃培养，检测范围只包括一群在普通营养琼脂中生长发育，嗜温需氧及兼性厌氧的细菌菌落总数。国外用于食品、化妆品中微生物计数的螺旋平板计数法（SPC）也需 48±3h。这两种方法均为传统的培养方法，操作繁琐，费时费力。近年来，国内外在缩短检测时间、简化检测程序方面研究了一些新的检测方法。国家标准测定食品细菌总数。

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(1)  快速检验纸片法
目前已经有许多微生物检测纸片，可分别检测菌落总数、大肠菌群、霉菌、沙门菌、葡萄球菌等，这些纸片快速检测法与传统检测方法之间的相关性非常好。使用时应正确掌握操作技术和判断标准，从而达到理
想的检测效果。纸片法与国标法在霉菌检出率上无显著性差异，且菌落典型，易判定。纸片荧光法利用细菌产生某些代谢酶或代谢产物的特点而建立的一种酶－底物反应法。同时纸片可高压灭菌处理、4℃保存，
简化了实验准备、操作和判断.
5]。

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(2)  免疫学方法
免疫学技术通过抗原和抗体的特异性结合反应，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌。免疫方法的优点是样品在进行选择性增菌后，不需分离，即可采用免疫技术进行筛选。由于免疫法有较高灵敏度，样品经过增菌后可在较短的时间内达到检出度，抗原和抗体的结合反应可在很短时间内完成。现在主要包括 ATP  生物发光法和微型自动荧光酶标分析法（mini VIDAS）.

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(3)  分子生物学检测方法
聚合酶链式反应( polymerase chain reaction ,PCR)是近年来分子生物学领域中迅速发展和广泛应用的一种技术。PCR  技术检测细菌的基本原理都是应用细菌遗传物质中各菌属菌种高度保守的核酸序列，设计出相关引物，对提取到的细菌核酸片段进行扩增，进而用凝胶电泳和紫外核酸检测仪观察扩增结果。目前对该方法自身的应用研究也日新月异，如派生出免疫捕获 PCR、荧光定量 PCR、基因芯片技术等。

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(4)  细菌直接计数法
主要包括流式细胞仪(flow  cytometry,FCM)和固相细胞计数(  solid phase  cytometry,SPC)法。流式细胞仪通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。流式细胞计数具有高度的敏感性，可同时对目的菌进行定性和定量。固相细胞计数可以在单个细胞水平对细菌进行快速检测。滤过样品后，存留的微生物在滤膜上进行荧光标记，采用激光扫描设备自动计数。每个荧光点可直观地由通过计算机驱动的流动台连接到 ChemScan  上的落射荧光显微镜来检测，尤其对于生长缓慢的微生物，检测用时短使该方法明显优于传统平板计数法.

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(5)  放射测量法
放射测量法根据细菌生长繁殖过程中，可利用培养基中加 14C 标记的底物代谢产生 14C02，然后测量 14C02的含量以确定标本中有无细菌存在。Previte 首先将 RM 用于检验食物中的细菌；Rowley等用
Bactec301 型仪器检查熟食（包括油煎鸡，熟肉包）、各式牛排、烤猪肉、羊肉等中细菌的含量，73%的样本可在 6-7h 内获得结果，27%的可疑标本则需用常规法作进一步检查；Weinstain用 RM 法对水和食品中的细菌进行检测。

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(6)  阻抗检测法
近年使用阻抗法检测细菌总数的研究报道较多，早在 1974 年英国的 Stratfen 公司就制造了阻抗测量装置，同年美国 Bactomatic 公司研制Bactometer-32 检测仪。Kang等用 Bactometer 对鲜奶进行检测，并与SPC 相比，在不同的温度下检测表明，培养温度 35℃最佳，相关系数 r= 0.  93，并可以在 6h 内完成检测；Teger用 Bactoscan80 检测牛奶，与SPC 相比，符合率为 0.95。顾其芳等用美国 VITEK 公司微生物自动分析仪对消毒牛乳、灌肠进行检测，结果表明灌肠相关系数（r）为 0.91，牛乳为 0.95，可在 16h 内完成检测；易敏英等报道，用 Bactometer检测牛奶在 7-8h 内可完成操作；法国生物梅里埃公司的 Bactometer 可对奶制品、饮料、肉类、禽类、水产品等进行检测，6-24h 报告结果.

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(7)  微菌落技术
微菌落技术具有快速、经济、实用的特点，其研究始于 50 年代，定量测定技术从 70 年代开始，国外学者将其用于水、食品中细菌总数的检测。2001 年许欣用微菌落技术对矿泉水中的细菌总数进行检测，结果经统计学分析，P>0.05，与国标法比较无显著差异。微菌落技术由于采用大面积加样和显微因子的计数计算方式，使得该方法的最低检出限局限于 103cfu/mL 以上，限制了该技术的推广应用。