【转载】发酵来源的化学药物的菌种鉴别－国家评审中心意

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通过发酵获得的化学药物同其他化学合成的药物一样，审评时应适用同样的技术要求。但通过发酵获得的化学药物同纯化学合成的药物也存在不一样的特点，在应用以上原则时会有不同的具体要求。在发酵的过程中，原本在化学合成中的一步或多步化学反应在菌体内，通过菌体的初级或次级代谢完成。而目前尚无有效手段，可对这些代谢过程如调控化学反应一样进行精细的监控。但可以通过对菌种，发酵条件和工艺过程的确认，间接的判断生产工艺的可行性。为了降低这种间接的判断带来的药品质量方面的安全性风险。因此研发单位应对菌种鉴别和发酵工艺进行深入研究；寻找药品质量与二者之间的直接联系，判断和控制影响药品质量的关键参数。



本文将根据文献调研的结果，结合审评工作的实践，对发酵来源的化学药物的菌种鉴别的技术要求谈一点自己的看法。



通过发酵得到的药物很多，大体可分为以下三类。第一类是由生物整体或部分实体的药物；如菌苗、疫苗、类毒素等自动免疫制品；抗毒素、抗血清等被动免疫制品；诊断用菌液、血清、毒素、抗原、抗体等诊断制剂以及治疗用抗体制剂等，统称为生物制品。该类制品不在本文讨论的范畴。第二类为微生物初级代谢产物；如构成机体大分子骨架的氨基酸、核苷酸，和辅酶、酶的辅基、维生素等非机体构成物以及与物质代谢、能量代调有关的有机酸、醇类等。第三类为来源于微生物次级代谢产物的药物；其中最著名的一类药物就是抗生素；其他还包括酶抑制剂与诱导剂，免疫调节剂与细胞功能调节剂、受体拮抗剂与激动剂以及具有其他药理活性的物质。



初级代谢产物和次级代谢产物的生产依赖于其生产菌种特异性的积累目标产物，因此原则上要求菌种鉴别的专属性越高越好；一般应当将生产菌株与同种不同株的其他菌株区分开。对菌株进行鉴别提供形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学成分四方面的资料。此外还可采用DNA 杂交法，16SrRNA 基因序列分析，RELP，RAPD等手段对对同一种属的不同菌株进行鉴别。但因初级代谢产物主要是生长所必须的小分子化合物，代谢路径较明确，在各种生物中差异较小；因此对菌种鉴别可适当放宽技术要求。如氨基酸生产菌的菌株多为某些营养缺陷型的菌株，因此结合形态特征资料和生理生化特征资料就可以较好的保证菌株的专属性。次级代谢产物通常与微生物的基本生命活动无关，其合成过程要比初级代谢复杂得多；但从次级代谢产物中分离得到的有用的药物也要多得多。次级代谢过程按照起始分子和反应模式可进行如下划分：I级反应，初级代谢产物被转化为次级代谢产物的中间体。II级反应，主要是缩合，相近的小分子单元被聚合成大分子，为次级代谢的关键步骤。III级反应，对次级代谢产物的基本结构进行各种修饰，常常导致产生一族的大量类似物。由此可见，要保证得到正确的可作为药物的次级代谢产物，就应当保证在生产中使用了正确的菌种。且由于次级代谢的复杂性，同种不同株的生产菌可能产生很多物理化学性质（但药效未必相同）非常相似的类似物，分离难度很大，因此必须在申报资料中提供详细的生产菌株鉴别资料。否则产品的质量可控性无法保证。值得一提的是，发酵来源的化学药物，尤其是分子结构较复杂的次级代谢产物，应该通过过程控制保证产品质量；因此在生产工艺的技术要求上，仿制药和创新药并无区别。同样应当提交详细的菌种鉴别和生产工艺研究资料。



目前的菌种的分类检定主要依据细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等表型特征,这些方法能对菌种进行初步分类。随着分子生物学的发展,出现了多种对细菌分类、鉴定的DNA 技术,它们的分类适用范围、辨别力、重复性、解释难易度和标准化各不相同。以下参照文献，对各种菌种鉴别方法做简单介绍。



【1】G+ Cmo1 %含量的测定；不同细菌DNA 有不同G+ C 含量的平均值,同种细菌菌株间的差异不大于5 % ,同属间种的差异不超过15 %。测定( G + C) mo1 %的方法主要为热变性法,其原理为:天然DNA 在一定的离子浓度和pH 介质中不断加热变性时,随着碱基之间氢键的不断打开,互补双螺旋不断变成单链,导致核酸碱基在260 nm 紫外吸收明显增加,当双链完全变成单链后,紫外吸收停止增加,在热变性过程中,紫外吸收增加的中点值所对应的温度为热变性温度( Tm) 。Tm 值就是通过升高温度使吸光度增加来测定的,细菌DNA 中G+ C 含量越高,其Tm 值也较高。用此方法能将不同种的细菌区别开,操作较简单,但分辨力不高,不能对菌株进行区分。



【2】16SRNA 基因序列分析其原理为:以16SrRNA 模板,以一个或多个寡核苷酸链作引物,用反转录酶合成cDNA。反应体系由4 支反应管组成,分别测定A、T、C、G 四种碱基。每个反应管中都加有dNTP 和一种ddNTP ,ddNTP 随机加入到DNA 链中,通过改变dNTP 的浓度比例即可控制ddNTP 的掺入机会,即控制链的延长反应。反应到预定时间后,4 支管的反应物同时在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离,电泳结果可以用放射自显影显示,再从自显影图谱上直接读出16SrRNA 序列。特异性和灵敏度较好，可用于检定生产菌的种属，但不一定适用于同种不同株的生产菌鉴别。



【3】PFGE( Pulsed - field gel elect rophoresis) 脉冲电场凝胶电泳。所有超过一定大小的线状DNA 分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率相同。当线状DNA 双链体的螺旋半径超过凝胶孔径时,即达到分辨力的极限,此时凝胶不能再按分子大小筛分DNA ,DNA象通过弯管一样,以其一端指向电场一级而通过凝胶。这种迁移模式谓之“爬行”。即使低浓度的琼脂糖也不能分辨大于750kb 的线状DNA 分子。PFGE在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后,大DNA 分子便滞留在爬行管里,直至沿新的电场轴向重新定向后,才能继续向前移动,DNA 分子越大,这种重排所需要的时间就越长。若DNA 分子变换方向的时间小于电脉冲周期时. DNA 分子就可以按大小分开。现在已可分辨大于5 000kb 的DNA 分子。PFGE 被认为是分子生物学分类方法的“金标准”，可用于比较不同的菌株。但PFGE耗时较长, 需2 ～ 3天。



【4】RFLP ( Rest riction Fragment Length Polymorphisml) 限制性片段长度多态性。不同细菌有其独特的核苷酸序列,用同一种限制性内切酶切割不同细菌基因组DNA 后会产生不同长度的限制性片段,这种限制性片段长度多态性可通过电泳分析表现出来。RFL P 作为检测细菌种内或种间DNA水平的最敏感的方法之一，可作为种以下菌株间的鉴定方法。



【5】RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)随机扩增多态性技术,其原理为:采用核苷酸序列的随机引物进行基因组DNA 扩增,非特异性引物可以结合在模板DNA 的多个位点,产生多个PCR产物,采用琼脂糖凝胶电泳将产物分离开,将每株菌在每条引物下扩增后产生的图谱合成为针对一株菌的单一图谱, 再通过软件进行分析。此方法的敏感性和特异性在于细菌的整个基因组作为基础产生DNA 图谱。细菌种、株间基因特异性可通过获得DNA 片段大小及数量来确定。它对于区分亲缘关系近的细菌非常有效。与其它方法相比较,本方法快速,区别程度高,不需要对基因组DNA 有更深入详细的了解。



【6】AFLP(扩增片段长度多态性分析) 为选择性限制片段扩增技术,先用一中等切割频率(如EcoRI)和一较高切割频率(如Mse I) 限制性酶消化少量纯化DNA ,再将二个接头(含各自的限制性位点,但在接头序列中掺入点突变,在连接后,原限制性位点不恢复) 与基因组限制片段两端连接,然后用接头特异引物在严格条件下进行PCR 扩增,在引物3′端有1～3个选择性核苷酸伸入未知染色体限制片段内。本法要求DNA 量少,且不须杂交,故避免了限制性片段长度多态性(RFLP) 基因分型不可重复的原因———DNA 部分消化和不清晰图谱,而且AFLP 在实验室内和实验室间重复性均好,可把图谱储存在数据库中,用于先前或今后以及实验室间图谱比较和鉴定新菌株。AFLP分析可用作菌种鉴定和菌株区分(90 %～100 %同源性为相同株,60 %～90 %同源性为同种不同株,40 %～60 %同源性为同属不同种, <40 %为不同属) 。AFLP分析具有与RFLP，RAPD 等相同的分类学范围,并兼有这些技术的优点,在多数情况下有最高的分辨力。



申报单位应根据生产的实际，选择适当的菌种鉴别手段对生产菌株进行鉴别，提供详细研究资料，以证明产品质量可控。

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