氨基酸混合物的分析分离

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氨基酸混合物的分析分离


(一)分配层析法的一般原理
层析法即色层分析也称色谱法.所有的层析系统通常都由2个相组成,一个为固定相,一个为流动相.混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相中的分配情况,一般用分配系数来表示.
分配系数(Kd)是指一种溶质在两种给定的互不相溶的溶剂中分配时,在一定温度下达到平衡后,溶质在两相中的浓度比值:
Kd=流动相中溶质的浓度/固定相中溶质的浓度
利用层析法分离混合物,其先决条件是各种氨基酸成分的分配系数要有差异,哪怕是很小的差异.一般差异越大,越容易分开.
举例见p149.
从分溶曲线可以看出,分配系数大的物质沿一系列分溶管的移动速度要比分配系数小的物质快.还可以看出,每一种物质在一系列分溶管中是相当集中的,分溶曲线呈峰形,因此只要使用足够数目的分溶管,继续进行分配,就可以使两个峰彼此完全分开.一定量的某一溶质在一定量的溶剂系统中分配时,转移次数越多,其分溶曲线的峰形越窄而高,这样有利于混合物中各物质的完全分离.
(二)分配柱层析
层析柱中的填充物都是一些亲水性的不溶物,如纤维素,淀粉,硅胶等.支持剂吸附着一层不会流动的结合水,可以看作为固定相.沿固定相流过的与它不互溶的溶剂是流动相.由填充料构成的柱床可以设想为由无数的连续板层组成,每一板层起着微观的分溶管的作用.当洗脱剂洗脱时,即流动相流动时,加在柱上端的氨基酸混合物样品在两相之间将发生连续分配.混合物中具有不同分配系数的各种成分以不同的速度向下移动.分部收集柱下端的洗出液.
(三)纸层析
纸层析也是分配层析的一种.纸层析是以滤纸纤维素上吸附的水为固定相,展层用的溶剂作为流动相.展开时,有机溶剂在滤纸上流动,样品中各物质在两相之间不断地进行分配.由于各物质有不同的分配系数,移动速度因此不同,从而达到分离的目的.
纸层析是分离,鉴定氨基酸混合物的常用技术,可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定.将氨基酸混合物点在滤纸的一个角上,称原点.然后在密闭的容器中用一个溶剂系统(如丁醇—乙酸)沿滤纸的一个方向进行展层.烘干滤纸后,旋转90.,再用另一个溶剂系统(如苯酚—甲酚—水)进行第二向层层.由于各种氨基酸在两个溶剂系统中具有不同的Rf值,因此就彼此分开,分布在滤纸的不同区域.当用茚三酮溶液显色时,得到一个双向纸层析谱 (图3—25).
溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示:
Rf=溶质斑点中心的移动距离/溶剂前沿移动的距离

(四)薄膜层析
薄层层析分辨率高,所需样品量微,层析速度快,可使用的支持剂种类多.如纤维素粉,硅胶和氧化铝粉等,因此应用比较广泛.
薄层层析的大体步骤如下:把支持剂涂布在玻璃板上市成一个均匀的薄层,把要分析的样品滴加在薄层的一端,然后用合适的溶剂在密闭的容器中进行展层,使样品中各个成分分离开来,最后进行鉴定和定量测定.
(五)离子交换层析
离子交换层析是一种用离子交换树脂做支持剂的层析法.离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯和苯二乙烯等不溶性高分子化合物.树脂一般都制成球形的颗粒.
阳离子交换树脂含有的酸性基团如磺酸基(一S03H),磷酸基(一P03H),亚磷酸基(一PO2H),羧基(一COOH),酚羟基(一OH)等,可解离出H+,当溶液中含有其他阳离子时,例如在酸性环境中的氨基酸阳离子,它们可以和H+发生交换而"结合"在树脂上.同样的阴离子交换树脂含有的碱性基团如一N(CH3)3OH或一N(CH3)2可解离出OH-,能和溶液中的阴离子,例如和碱性环境中的氨基酸阴离子发生交换而结合在树脂上.
分离氨基酸混合物经常使用强酸型阳离子交换树脂.在交换柱中,树脂先用碱处理成钠型,将氨基酸混合液上柱.在PH2-3时,氨基酸主要以阳离子形式存在,与树脂上的钠离子发生交换而被挂在树脂上.氨基酸在树脂上结合的牢固程度即氨基酸与树脂间的亲和力,主要决定于它们之间的静电吸引,其次是氨基酸侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水相互作用.在PH3左右,氨基酸与阳离子交换树脂之间的静电吸引的大小次序是碱性氨基酸〉中性氨基酸〉酸性氨基酸.因此氨基酸的洗出顺序大体上是酸性氨基酸,中性氨基酸,最后是碱性氨基酸.由于氨基酸和树脂之间还存在疏水相互作用,所以氨基酸的全部洗出顺序如图.为了使氨基酸从树脂上洗脱下来,需要降低它们之间的亲和力,有效的方法是逐步提高洗脱剂的PH和盐浓度,这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来.