【原创】[C标记代谢流blog]碳标记代谢流实验细节问题

细履平沙

我们正在准备开展C13标记代谢流的课题了，在之前要理清思路，在这个课题中涉及了许多细节问题，不是说细节决定成败的关键吗？所以这个贴子将逐渐记录一下碳13标记实验的细节问题。
这个贴子以后还会进行整理修改，但是目前可能会比较零乱，而且思路也可能会出差错，如果朋友们发现不明白或不正确之处，希望不吝赐教。引入出处www.fajiaoren.com
1、开始之前要进行必要的假设，比生长速率不变时，所有菌体都处于相同的代谢状态，这时胞外的标记物被均匀的摄到胞内，在胞内与普通物质利用的机会均等。比生长速率不变是实验的基础，如果菌体处理静止期，那么它就不会利用胞外的C13标记物，这样会使计算误差增大。代谢流计算的基础是物质平衡（元素平衡，同位素异构体平衡）。
2、要先把代谢网络图拼凑起来，如果找不到模型菌的代谢结构图就找生物化学书上的通用结构。然后初步估计一下有多少个自由度，再确定需要检测的参数。参数的数目要比自由度多，否则这个系统将是不确定系统。引入出处www.fajiaoren.com
3、代谢流计算的数据要来自于培养过程，如果细胞不代谢了，就会使假设条件发生变化，带来计算误差
4、代谢流计算的数据要来自于培养过程，于是良好的培养环境不可缺少，而且环境不能引入不可控制的变量（如一些复合培养基中的碳源，这些碳源是不可测量的，因此不能使用复合培养基）。在实验中我们准备使用合成培养基，但是合成培养基的缺点就是细胞生长慢，利用C源少，这样会使计算的误差增大。
5、以下还在思考中......

减小误差计算的方法：
1、保证细胞对标记物利用得多
2、初始的C标记的信息丰富，混合标记的效果优化单一标记
3、检测要准确，而且检测限要低，否则将失去同位素的信息。当检测参数小于自由度时，系统成为不确定系统将不能进行计算。
4、思考中......

细履平沙

以下是原创贴：来自发酵人网站。 引用请注明出处 作者：细履平沙
提示：
1、实验中需要对无机培养基进行优化，种子可以用复合培养基，但是接种前需要对种子液进行离心和清洗，去除种子液中的干扰物质。
2、本论坛中有一个贴子中，在模式菌的代谢网络结构图，每个物质是用结构式写的，所以对于确定原子映射很有用。
3、对于一些物质，如对称结构，可以设左右开始的几率相同。这样一个物质就要写出2个方程了。
4、蛋白质氨基酸有20种，但是不要以为这些氨基酸都能用于计算。因为用于计算的数据是要能够检测出来的。如果氨基酸数据不够用时，需要检测其它物质，这里可能要用到HPLC-MS/MS。因为GC-MS检测不到。（from www.fajiaoren.com 引用请注明出处 作者：细履平沙）
5，关于使用MS/MS，一开始我也有些疑问，用一级MS就可以了，为何要用2组呢？当我建立好了计算模型后，发现，对于同位素异构体而言，如果不能确定每一种的丰度，那么这样就会增加自由度，导致计算精度下降，如果用2组MS，就可以使系统的自由度大大降低。
6，思考中......

细履平沙

1、直接计算会有许多困难，因此目前多数情况用到了优化算法，给定几组初始值，然后将它们代入模型，计算出代谢物的同位素丰度，再将丰度转换成MS图（计算MS图）。然后再将计算MS图与实际MS图进行比较，计算出误差。根据误差情况决定是不是对初始值进行修正。直到获得满意的结果，这时停止计算，输出各个反应速率（代谢流）。
2、遗传算法比较适用于这样的计算过程。
3、当计算达不到要求时，要考虑修改代谢结构或更换检测数据。对于计算结果影响最大的是网络结构，如果它错误了，那么计算无论如何都达不到要求。
4、方程中最重要的公式就是菌体合成的方程了，目前大家做代谢流分析，都是用文献上的数据，而文献上菌体合成的公式也是一个简化的模型，我感觉引入文献不太合理，因为代谢流计算和菌体合成的公式应该是同时计算出来的，以前没有引入代谢流的概念，因此公式虽然是左右平衡的，但是仅是拼凑而已，与实验情况出入很大。
5、思考中......

细履平沙

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happywin

看到了,呵呵@@

kittysnown

很想看如何选择初始标记物，可惜威望不够呀！

kittysnown

很想看如何选择初始标记物，可惜威望不够呀！

koler88

有机会讨教下，呵呵

culeanimal

看看~~~~~~~~~~~~~~~

culeanimal

威望要10~~~~~~~~