种子岗位sop

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种子岗位sop
一、种子岗位原材料性能与规格

名称               规格             备注
葡萄糖             口服或药用           
牛肉膏                              
蛋白胨                              
NaCl                                 
酵母膏                              
琼脂                                 
玉米浆             工业级
硫酸铵             工业级
KH2PO4             工业级
MgSO4             工业级
CaCO3             工业级

二、种子岗位的操作方法与要点
（一）斜面与茄子瓶菌种制备法
1、准备工作：
试管与茄子瓶清洗干净，烘干，塞好棉塞，外面罩一层牛皮纸，空消0.1Mpa,1小时，空消完毕后，烘干备用。
2、配料：
试管斜面与茄子瓶斜面配料相同
牛肉膏1%；蛋白胨1%；NaCl 0.5%；葡萄糖0.5%；酵母膏0.3%；琼脂3%
PH7.0-7.2，灭菌121℃ 30分钟，稍冷后，摆成斜面，空白斜面31℃培养2天左右，检查无菌后，方能使用。
3、取冰箱保存的斜面或奶管，在无菌室中，在超净工作台无菌状态下接种，接种时挑取斜面的中间一段，两头不用。接种后，与培养箱中31℃培养24-48小时，可用于接种液体种子或发酵摇瓶。

（二）液体种子制备方法
1、准备工作：
将三角瓶清洗干净，烘干，塞好棉塞，盖上8层纱布，外面罩一层牛皮纸，空消0.1Mpa,1小时，空消完毕后，烘干备用。
2、配料：
玉米浆4%；葡萄糖3%；硫酸铵 0.5%；KH2PO4 0.1%；MgSO40.05%；CaCO3 1%；PH7.0±0.1，灭菌121℃ 30分钟，玉米浆配料前先预消121℃ 20分钟，CaCO3 干热160℃ 30分钟。然后在配置种子培养基
玉米浆预消时，应先加水适量稀释，然后再分消，否则将增加玉米浆中营养成分的破坏程度。但配培养基时需出去加水量。
分装：500ml三角瓶中装量100ml培养基。

3、接种培养
在无菌条件下，按无菌操作，接种固体菌种一环，于29-31℃，230rpm左右的旋转摇床上，培养10-20小时

（三）摇瓶发酵
1、准备工作：
将三角瓶清洗干净，烘干，塞好棉塞，盖上8层纱布，外面罩一层牛皮纸，空消0.1Mpa,1小时，空消完毕后，烘干备用。
2、配料：
玉米浆2%；葡萄糖15%；硫酸铵 5%；KH2PO4 0.11%；MgSO40.055%；CaCO3 4%；PH7.0-7.2。
分装： 500ml三角瓶中装量100ml培养基
实消：110℃ 10分钟
注意：在量取玉米浆时应先将玉米浆搅拌均匀
3、接种培养
在无菌条件下，按无菌操作，在三角瓶中接种固体菌种一环，成液体种子5%的量（1.25ml或1.5ml）于29-31℃，230rpm左右的旋转摇床上，培养4天（90-96小时）左右或者5天，即以残糖〈0.8%的发酵结束。

（四）斜面菌种质量标准
  镜检

（五）操作的注意事项
1、配置液体种子和发酵培养基时，先调好PH，之后再加入CaCO3
2、在配制摇瓶发酵培养基时，实际配置的体积应稍大于欲定的体积，可稍大于5-10%
3、分装时，需在搅拌状态下进行，可用吸管或者量筒量取
4、保藏时间稍长的斜面菌种或安瓿管菌种，用于摇瓶发酵或罐上发酵时，均应先进行菌种的分离纯化，以筛选去掉变异株。
5、接种前必须仔细检查斜面与茄子瓶的情况，如发现杂菌污染时，必须停止育种，销毁菌种。
6、摇床间温度要经常检查
7、生产上使用的菌种，每半年分离一次，若筛选或诱变出好的菌种，除用斜面保存外，必须同时做冻干菌种保存备用

三、环境卫生与无菌操作

1、摇床间与无菌室卫生标准：
每星期一次用75%乙醇搽摇床间，无菌室和走廊的墙壁，操作台等，用5%煤酚皂溶液和稀释的新洁尔灭溶液（0.5%）轮换搽地板，最后开紫外灯照射30分钟。
定期用乳酸或甲醛+高锰酸钾溶液熏无菌室和摇床间。
无菌室和摇床间，每周在搞卫生之前，作一次无菌检查。
无菌检查的操作方法：将平板打开半小时，然后盖起来，在30-32℃条件下培养，平板菌数不会超过三个。
2、冰箱：定期用75%的酒精搽，定期化冰，每天检查冰箱温度是否正常，发现异常，及时通知维修，并安排好菌种的有效保存。
3、无菌操作
（1）操作前，无菌室用紫外灯照射30分钟。超净工作台，开30分钟后。用新洁尔灭溶液洗手，然后用75%的酒精对手进行消毒。换无菌衣，口罩，帽子，拖鞋等。无菌衣，口罩，拖鞋每星期洗一次，并灭菌。
（2）接种前，用75%酒精搽茄子瓶，试管斜面等一切用皿和操作台。
（3）操作结束，清除废物，再用75%酒精搽操作台，最后用紫外灯照射30分钟。
（4）试管棉塞，三角瓶上纱布潮湿或沾有培养基均不能使用。
（5）无菌室及摇床间门要及时关闭，操作时动作要快，轻不带风，以免染菌，在挑菌落是要防止菌液粘在管口或瓶口上，一切操作均在无菌条件下进行。

四、无菌检查

1、空白斜面经48小时培养检查，无杂菌，培养基比较湿，（斜面上部无裂痕，下面无冷凝水）方可使用。
2、无菌室，摇床间，冰箱每周在搞卫生之前作无菌检查，将平板打开30分钟，合上平板，30-32℃培养24小时，菌落数不得超过3个。
3、每周做噬菌体检查（用双重平板法来做），培养24小时后镜检平板情况，并填写报告单，如有噬菌斑及时通知主管领导。

五、菌种的分离与纯化

1、制无菌空白斜面和平板：培养基配方同斜面种子培养基配方相同。
1）无菌斜面的制备方与前面相同
2）无菌平板的制备：
将培养皿（9㎝）洗净，烘干，用牛皮纸包扎好，于121℃，30分钟灭菌。在无菌条件下，按无菌操作将事先已灭菌好的培养基注入培养皿中，待皿中培养基凝固后，将平板放入培养箱中倒置培养48小时，经检查无菌后方可使用。
2、分离用具的准备
1）装有100ml0.85%生理盐水和10-70枚玻璃球的300ml三角瓶一个。
2）装有4.5ml生理盐水的180㎜×180㎜的试管7支
3）三角形型的玻璃刮刀3支以上，接种铲或接种环一支。
4）1ml的吸管6支以上，（一头塞有少许棉花）
5）0.1ml的吸管或0.5ml的吸管6支以上（一头塞有少许棉花）
6）300ml一三角瓶一个（上置玻璃漏斗和少许棉花）
将上述用具于121℃ 30分钟灭菌后备用。
3、分离步骤（以上操作步骤均需在无菌条件下进行）
1）用300ml三角瓶中的无菌生理盐水将试管斜面菌种刮洗下来，倒入此三角瓶中，用手或摇床摇动30分钟。以便于瓶中的玻璃珠将菌落打散。
2）30分钟后，用塞有棉花的漏斗将此菌悬液过滤。
3）编号：取7支盛有4.5ml无菌水的试管排列于试管架上，依次标上10-1、10-2 、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7字样。
4）稀释：以1ml无菌吸管按无菌操作从滤液中吸取0.5ml菌液于10-1、试管中，然后用另一吸管在10-1试管来回吹吸3次，使其混合均匀，制成10-1 稀释液。再用此吸管从10-1管中吸取0.5ml稀释液注入10-2 管中，依次制成、10-2 、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释液。
5）倾注平板：将灭菌好的培养基冷到45℃左右，注入各培养皿中，每次加的培养基约10-15ml，正放，使其凝固。
6）用0.5ml的吸管分别吸取10-5、10-6、10-7稀释液0.1 ml注入已编号好的10-5、10-6、10-7培养皿中，并用   型玻璃刮刀将稀释液涂布均匀。
7）将培养皿包扎好，放入培养箱31℃恒温培养48小时。
8）48小时后，从培养皿中挑取黄色单菌落48个（或若干个）各接种斜面一支，每支试管斜面均需做上标记，31℃恒温培养24小时左右。
9）将上述斜面进行传代。
10）传代后，上摇床进行初筛，初筛后得到发酵单位高的几支斜面进行复筛，把发酵单位高，且稳定的菌株上罐试用，试用时发酵单位高，而且提取和精制情况良好者，才为生产上正式使用，并对此菌株做冷冻管保存。
4、生产上使用菌种，为保存菌种的活力，传代次数一般不能超过两代。一般使用二代斜面，特殊情况下方可使用一代斜面。

六、复核制度：
（1）、试管斜面，茄子瓶，摇瓶配料过程必须一个人称料，一个人复核。
（2）、各种试剂的配制，在培养基的配置，在配置前必须先计算好，在称量时，一个人操作，一个人核对。
（3）、各种实验的结果送车间主任或技术主管审核，以便安排生产试验。

七、安全防火劳动保护：
（1）、种子间应备有灭火机。
（2）、电炉用完后，将插头随手取下。
（3）、灭菌器，蒸馏水器。电炉等设备或仪器在使用是操作人员不可离开，以免发生意外事故或损坏设备或仪器。
（4）、烘箱，电炉等设备或仪器下班前必须检查，关闭后方可离开。
（5）、湿手、湿抹布不得接触电源。
（6）、配置酸碱溶液及洗液时，必须戴浸塑手套操作。
（7）、使用吸管时，必须用洗耳球，不能用口吸。

八、度量衡器的检查与校正：
（1）、精密天平，每年由计量所校正一次，发现问题，及时请人修理。
（2）、各种温度计表定期校对。（或使用前校对）

九、主要设备的维护和使用
（1）、显微镜
（2）、比色计
（3）、分光光度计
（4）、分析天平
（5）、电子天平


十、分析方法
1、PH测定
2、生长测定
3、糖的测定
4、氨基酸含量的测定

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非常好，值得参考