酵母菌

tfsh2008

酵母菌的分类鉴定原则
公元前6000年埃及就有酿造酸啤酒的记录,公元前1000年埃及和中国对使用酵母菌酿酒,制作面包的技术已相当成熟,直到1860年丹麦的酵母专家Emil Christian Hansen首先对酵母菌进行分类研究,他成为研究酵母菌的创始人.以后人们提出了多种分类方法并不断改进,其中比较著名被人们普遍接受的是1983年Lodder和Barnett对酵母菌进行了系统分类方法,以后被人们广泛采用,直到现在人们一直使用这种分类方法,其原则步骤是:
    第一步:是否具有有性生殖过程，能否形成子囊孢子,具有掷孢子或冬孢子,以及孢子的形状,特点,数目以及能否形成真假菌丝分类到纲,目,科.
    第二步:根据菌落形态,细胞形状,增殖方式是否形成真假菌丝,结合少数糖类发酵和硝酸盐利用等试验分类归属.
    第三步:根据生理特征,其中糖的发酵和同化试验最为重要,利用硝酸盐分类到种.
2.酵母样菌的检验方法:
(1)直接涂片镜检: 寻找孢子或菌丝,如尿液常规观察细胞时也可直接寻找典型的孢子,菌丝根据形态而确定.
(2)氢氧化钾法: 百分之十KOH溶液透明标本,破坏其中的红,白细胞,上皮细胞，使视野更为清晰,容易辨认.
(3)革兰氏染色: 涂片革兰氏染色寻找蓝紫色的孢子或菌丝.注意报告时,最好能写明检出孢子还是菌丝及孢子伴有菌丝因为对于大部分酵母样真菌菌丝状态致病性更强.
   (4)墨汁负染法: 主要观察新型隐球菌的荚膜,出现典型的结构,形态而确定.
   (5)培养: 沙苞氏培养基是最常用的真菌培养方法，最好有两种温度25c,37c,培养48小时或5天观察菌落生长情况.
(6)鉴定程序:
    丝状真菌根据菌落形态,菌体形态,进行鉴定.
    酵母样真菌,首先菌落外观,再做芽管试验玉米粉吐温80观察真假菌丝，芽生孢子,再进行糖同化试验,糖发酵试验,硝酸盐利用试验,尿素分解试验综合分析，有条件的单位在生化反应基础上可用因子血清进行玻片凝集试验,分类出念珠菌和光滑球拟酵母菌.对于念珠菌还有分子生物学方法PCR技术进行基因分型鉴定,可用于病原学诊断及流行病学追踪调查作用.
3.病原性真菌分类鉴定的进展
   (1)(1-3)-β-D-葡聚糖定量测定: 真菌感染时,患者血中此成分升高,其含量与霉菌的活动呈平行关系.
   (2)化学分类法与计算机技术的结合： 此法大大提高了鉴定技术的准确性,主要是利用编码数值来进行鉴定.
   (3) 基因分类法: 限制性内切酶多态性分析技术: (RFLP)根据真菌 DNA顺序上发生突变获得或丢失某限制性内切酶识别位点,从而在酶作用后限制性片段的长度发生变化,而进行分型研究。
    基因探针和PCR法:人们发现酵母菌在进化过程中,它的rDNA具有很强的保守性,可利用它作为通用片段,可利用它作为真菌感染诊断，同时人们发现其两侧存在种属特异性片段,人们设计出种属特异性引物,PCR扩增进行有效的分类鉴定,此为随机PCR技术(RAPCR).分子生物学分类方法克服了传统表型分类方法程序烦琐,观察有误差,分型粗糙,易突变,重复性差缺点等,所以分子生物分类方法的应用势在必行.
   (4)染色题DNA的分离: 利用外周弧电极均匀电泳系统(CHEF)分离酵母菌的染色体DNA,根据其核型进行分类鉴定
   4.酵母样菌的的药敏实验:
抗真菌药有灰黄霉素,氟康唑,酮康唑,伊由康唑,特比萘芬,这些药物多依临床资料作为应用的依据,因为 NCCLS标准还没有完全确定所以药敏结果标准不一,只供临床参考使用.它的实验室药敏试验相对滞后.由于其药液在琼脂中不能很好的扩散,培养时间较长等原原因,所以多不采用琼脂扩散方法,而采用肉汤稀释法进行MIC值测定.此法应用仪器法比较方便.
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