真菌淀粉酶

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真菌α-淀粉酶研制

市场  
真菌α-淀粉酶是由真菌发酵产生的一种α-淀粉酶。与细菌α-淀粉酶不同的是，真菌α-淀粉酶的最适作用温度为55℃左右，超过60℃开始失活；其水解淀粉的产物主要是高含量的麦芽糖和一些低聚糖及少量的葡萄糖。而细菌α-淀粉酶最适作用温度高（中温α-淀粉酶70～80℃，耐高温α-淀粉酶为95～105℃），水解淀粉的主要产物是糊精。因此，细菌α-淀粉酶只能用于发酵工业，而真菌α-淀粉酶则广泛地应用于淀粉糖浆、低聚糖、啤酒、烘焙食品、面制品等的生产，具有十分广阔的市场前景。
在淀粉糖工业中可利用其代替大麦芽或β-淀粉酶作为糖化剂来制造麦芽糖含量达到50－60％得高麦芽糖浆。但产品糖分组成与传统饴糖有所不同。因为真菌α-淀粉酶制剂酶系远较麦芽要纯，故真菌α-淀粉酶饴糖色泽浅，纯度高，特别适合于质量要求较高的场合。利用真菌α-淀粉酶制造饴糖具有广阔的前景。
　   高麦芽糖浆是一种麦芽糖含量较高( ≥50 %) 而葡萄糖含量较低( ≤10 %) 的淀粉糖浆。因其具有无色透明、甜度低、熬糖温度高、吸湿性低、抗结晶性好等特点而成为糖果工业更新换代的产品,被广泛应用于糖果、蜜饯、果蔬汁饮料中。低聚异麦芽糖是近些年国内外市场上发展较快的一种功能性低聚糖。作为生产低聚异麦芽糖过程中α- 转移葡萄糖苷酶的作用底物,也要求这种淀粉水解产物中含有较高的麦芽糖、较低的葡萄糖和糊精。目前,国内外生产低聚异麦芽糖产品主要是以玉米淀粉为原料。国内外在低聚异麦芽糖生产工艺中主要采用真菌α-淀粉酶和α- 转移葡萄糖苷酶。应用真菌α- 淀粉酶的优点是不产生界限糊精,有利于过滤。
在焙烤工业面包加工过程中添加一定的真菌α-淀粉酶能使其质地松软，富有弹性。同时，由于真菌α-淀粉酶耐热性较低，在焙烤过程中，能将酶杀灭，而不至于产生过度液化，造成面包粘化。
应用实践表明: 添加真菌α-淀粉酶的面包专用粉,在制作面包时,其主要作用表现以下几个方面: 一是加快了面团发酵速度, 缩短了发酵时间; 二是改善了面包内部的组织结构, 使面包具有较好的松软度;三是增大了面包体积, 使面包表皮色泽良好而稳定;四是减缓了淀粉的老化,延长了面包的保鲜时间。
目前，人们对面粉的品种和品质提出了愈来愈高的要求。面粉生产企业为适应市场新的需求,近年来陆续开发生产了各类专用面粉,在生产面包、馒头等制作发酵食品的专用面粉时, 除面粉的面筋、灰分、粗细度、粉质曲线稳定时间等常规质量指标外,面粉工作者越来越关注面粉的α-淀粉酶活性。实践表明: 面粉的α-淀粉酶活性, 直接影响到面粉的发酵力和发酵食品的质量, 特别是低糖主食馒头。一般情况下,正常季节收获的小麦加工的面粉中α-淀粉酶的含量普遍不足, 国外面粉生产企业通常的做法是在生产这类面粉时, 添加麦芽粉或真菌α-淀粉酶, 用来提高面粉中α-淀粉酶的活性, 以改善和提高发酵食品的质量。麦芽粉是在适当的温度和水分下使大麦或小麦发芽、干燥后加工成粉。其酶活性较低, 添加量为面粉的0. 2～0. 4 % , 因粘性较大,在实际应用中混合均匀较为困难。真菌α-淀粉酶是一种高浓度、高活性、易流动的粉末, 其酶活性为麦芽粉的40～50 倍,添加量小,操作方便。在美国、英国、加拿大等大多数欧美国家中, 真菌α-淀粉酶已完全代替麦芽粉作为面粉α-淀粉酶的增补剂,广泛地添加在面包、馒头专用面粉中。近年来,在我国面粉生产企业中, 其已逐步得到推广与应用,并取得了良好的经济与社会效益。
据市场调研，全国年需真菌α-淀粉酶1000余吨，其中淀粉糖行业每年需用酶500吨以上，啤酒、面制品等行业年需500吨左右。因此该产品具有广阔的应用范围和市场前景。若逐步取代进口产品，每年可节约大量外汇支出，降低用户的生产成本；同时还可以革新应用行业的生产工艺，提高产品质量，具有显著的社会效益。

供应商及产品
    目前，世界上仅有诺维信、丹尼斯克等少数几家大型酶制剂公司拥有真菌α-淀粉酶生产技术与产品，而国内真菌α-淀粉酶的生产还是空白（最近，湖南尤特尔酶制剂有限公司有产品出售，至于是自己生产还是代理国外产品情况不明；国内其他供货商基本是代理国外品牌）。近年来，浙江、江苏等地的几家高校相继开展了真菌α-淀粉酶的研究工作，但仍处于实验室阶段。国内报道的真菌α-淀粉酶的发酵单位仅为200～600u／g，而世界上处于领先地位的几家酶制剂公司真菌α-淀粉酶的发酵单位已达到1500～2000u／g。
    对于我国来讲，一方面食品与发酵工业的发展对真菌α-淀粉酶的需求量不断增加；另一方面，由于我国目前不能自主生产真菌α-淀粉酶，每年都要大量进口，且价格昂贵，其市场售价一般在250～300元／Kg（9000u／g）。因此，研制开发真菌α-淀粉酶，尽快实现国产化生产，对于满足市场需求，调整我国酶制剂工业的产业结构，节约外汇支出等都具有十分重要的意义。
技术
菌种  生产工艺
2001年实施的中华人民共和国轻工行业标准QB2526－2001规定了由米曲霉（ Aspergillus oryzal var ）发酵法生产的真菌α - 淀粉酶质量标准。
“真菌α-淀粉酶研制”项目是采用现代生物技术研制开发的一种国内急需且又不能自主生产的新型酶制剂。要完成这项工作，涉及到优良菌株的选育、发酵培养基、发酵工艺条件和参数的优选确定；提取、纯化方法的选择，提取、纯化与设备的选择与确定；真菌α-淀粉酶酶学性质的研究测定，保存方法和保存条件的研究以及真菌α-淀粉酶应用研究等一系列内容。
      我们研制开发真菌α-淀粉酶的目的则主要是根据市场需要，根据企业发展需要，以实现真菌α-淀粉酶自主生产为根本目标的。
      我们以提高菌株产酶水平为突破口，以产品质量标准和应用结果为依据，以优化完善工艺技术。其主要研究内容与方法如下：
1.在菌株选育方面，采用已有米曲霉及其它食用菌备选菌种筛选出发菌株，目前对米曲霉的研究较多，单纯依靠优化培养基和优化培养条件已从开始的60-70u/g的酶活水平到现在的300u/g以上的水平，限于人力，还有不少想法未能进行验证，等优化各种培养条件完毕，保守估计酶活能提高到500u/g左右，再结合我们在等离子体诱变方面的经验，相信酶活还会有所提高。最终酶活能达到我们预定的目标。
2.在提取工艺技术方面，我们采用超滤浓缩工艺，同时还对影响酶提取收率的沉析工艺进行研究，建立先进、适用的提取纯化工艺技术，并应用于生产，使产品综合回收率稳定在70%以上。
真菌α-淀粉酶提取工艺流程图 ：
固态发酵（粗酶）—→水提 —→离心—→滤渣—→饲料
↓
超滤浓缩←—稀酶液
↓
乙醇沉析
↓
过滤—→酶泥（饼）
↓
低温烘干
↓
标准化—→成品

   参考耐高温α-淀粉酶的生产工艺，向成熟的发酵液中加入占发酵液重量1％-3％的钙离子保护剂或2％-5％淀粉中的至少一种，在70-90℃的条件下，进行热处理。将制得的纯化的耐高温α-淀粉酶送至压力喷雾塔进行喷雾干燥，制得酶粉，调配后，分装即得成品。
     
3.确定真菌α-淀粉酶的使用方法和保存方法，对该酶的酶学特性、稳定性进行试验研究。掌握真菌α-淀粉酶的最适作用温度、pH值等应用参数，确定酶的稳定剂组合和产品的保存方法。这些工作的完成，为真菌α-淀粉酶的应用提供可靠的理论依据，也为该酶的保存确定了有效的方法。
对于发酵工业和酶制剂工业来讲最能真实反映技术水平的指标来自两个方面，一是当发酵结束时，目的产物的产量或活力单位，二是提取、纯化、精制过程中的单项提取收率和综合提取收率。对比本项研究和国内外同类研究、同类技术我们的目标是：
1.发酵产酶水平对照
     目前国内外生产真菌α—淀粉酶的发酵方法均采用的是固态发酵法，主要原因是采用液体发酵时菌体产孢子多，产酶少，造成提取困难和产品色泽深。据目前掌握的情况，世界上处于领先地位的大型酶制剂公司的发酵产酶水平都已达到1500～2000 u／g。国内文献报道的最高产酶水平（600 u／g），达到1000 u／g的水平就存在足够的利润空间。
2.提取工艺和综合回收率比较
     目前，国际上酶制剂的提取、纯化、精制普遍都采用超滤浓缩、冷冻沉析等先进的工艺技术，其综合回收率达到75%以上，而国内的酶制剂行业在耐高温α-淀粉酶等酶制剂生产上广泛采用了上述工艺技术，综合回收率达到70%以上即为国内先进水平。
     综上所述，就真菌α-淀粉酶的研发、生产的整体技术来讲，本项预期成果与国际先进水平还存在一定差距，但只要达到以上技术指标，本项目的研究水平、技术经济指标、先进程度在整体上将在国内处于领先水平。
附：
固体发酵的优点：
1. 培养基单纯，例如谷物类、小麦麸、小麦草、大宗谷物或农产品等均可被使用，发酵原料成本较经济。
2. 基质前处理较液体发酵少，例如简单加水使基质潮湿，或简单磨破基质增加接触面积即可，不需特殊机具，一般家庭即可进行步骤。
3. 因水分含量低可减少杂菌污染，此种低灭菌步骤即可施行的发酵，适合低技术地区使用。
4. 能产生特殊产物，如红麴产生的红色色素是液体发酵的十倍，又Aspergillus在固体发酵所产生的glucosidase较液体发酵产生的酵素更具耐热性。
5. 固体发酵相当於使用相当高的培养基，且能用较小的反应器进行发酵，单位体积的产量较液体为高。
6. 下游的回收纯化过程及废弃物处理通常较简化或单纯，常是整个基质都被使用，如做为饲料添加物则不需要回收及纯化，无废弃物的问题。
7. 固体发酵可食品产生特殊风味，并提高营养价值，如天培可作为肉类的代用品，其胺基酸及脂肪酸易被人体消化吸收。

固体发酵的缺点：

1. 限於低湿状态下生长的微生物，故可能的流程及产物较受限，一般较适合於真菌。
2. 在较致密的环境下发酵，其代谢热的移除常造成问题，尤其是大量生产时，常限制其大规模的产能。
3. 固态下各项参数不易侦测，尤其是液体发酵的各种探针不适用於固体发酵，pH值、湿度、基质浓度不易调控，Biomass不易量测，每批次发酵条件不易一致，再现性差。
4. 不易以搅拌方式进行质量传递(masss transfer)，因此发酵期间，物质的添加无法达到均匀。
5. 由於不易侦测，从发酵工程的观点来看，许多工作都只是在定性或观察性质，故不易设计反应器，难以量化生产或设计合理化的发酵流程。
6. 固体发酵的培养时间较长，其产量及产能常低於液体发酵。
7. 萃取的产物常因黏度高不易大量浓缩。

真菌进行固体发酵的优势

1. 能在较低含水分下生长(适水活性在0.7-0.93-0.98)，而细菌兴酵母菌的适水活性则大於0.99。
2. 细菌一般在低pH下就不易生长，而一般真菌能在低pH下也能生长良好。而固态培养基的pH很难调控，故真菌的此项特点有利於固体发酵。
3. 固态基质常为大分子化合物，如淀粉、纤维素、半纤维素、果胶、木质素、蛋白质和脂质等，真菌常能分泌这类的胞外分解酵素而利用其周围的培养基质作为碳源及氮源。
4. 真菌若具有产孢特性，则易於存放及接种，人员不需要太多训练即能进行孢子接种工作。
5. 菌丝的生长模式优於单细胞的生长方式，菌丝顶端延伸并分枝产生新的菌丝端，能迅速覆盖固体基质表面而有效利用基质。
6. 菌丝有分隔者，能透过孔洞(septal pore)传送物质，遇危险则孔洞自动封住，以避免细胞质流失；若为无分隔者，其细胞质内物质的传送迅速而使菌落快速繁衍。
7. 菌丝的生长渗透到固体培养基的力量强，形成很高的机械压力，配合尖端分泌的水解酵素，使穿入固体基质容易。