酵母蔗糖酶的提取及酶活测定

jiabenwang

酵母蔗糖酶的提取及酶活测定

一、目的：
    1、学习和掌握从酵母中提取蔗糖酶的实验方法；
    2、学习和掌握测定蔗糖酶活性等实验方法和技术。

二、原理：
    蔗糖酶在酵母细胞中存在着两种形式，一种存在细胞膜 外细胞壁中的高度糖基化的保外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，含有50％糖成分。 该酶是蔗糖酶的主要形式。而另一种是存在于细胞膜内侧细胞质中的低糖基化的胞内蔗糖酶。 蔗糖酶催化底物蔗糖分解成葡萄糖和果糖。葡萄糖和果糖具有还原性，可与3，5－二硝基水杨酸 共热后还原成棕红色物质，在一定范围内，葡萄糖的含量和反应液的颜色强度成正比例关系。

偏碱性
        还原糖＋3，5－二硝基水杨酸－－－－→棕红色络合物
水浴Δ

    蔗糖酶的酶活单位：在40℃水浴反应10min，测定吸光值OD540nm, 增加0.01个光吸收值的酶量为一个酶活单位(U)。

三、实验材料：酵母

四、实验设备： (1)离心机；(2)752分光光度计(玻璃比色杯)； (3)水浴箱；(4)电子天平,
台式天平；(5)碾钵。

五、试剂： (1)冰冻无水乙醇；  (2)0.01 mol/L PH6.0 PBS buffer, 2000ml
             (3)0.05mol/L蔗糖,用0.01 mol/L PH6.0 PBS buffer 配制，100mL
             (4)2mol/L NaOH, 100mL；  (5)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂：100mL

六、实验方法：
(一)粗提取酵母蔗糖酶
(1)量取5g面包酵母，分几次碾磨（加入少量石英砂）至粉状，加入10-12mL 0.01mol/L PBS(PH6.0)，搅拌混合。置于小烧杯中。
(2)置于-20℃冰箱中，反复冻融2-5次。
注意：为了节省时间，上两步操作可实验前完成。
(二)热提取酵母蔗糖酶
(3)解冻，然后置于离心管中，离心，11000r/min离心15min，离心后取上清夜，测酶活A。
(4)将上述上清夜置于45℃恒温水浴锅中，用玻璃棒缓慢搅拌30min,然后冰浴中迅速冷却 5min。然后装进离心管中，离心，11000r/min条件下离心15min，离心后取上清夜，测酶活B。
(三)乙醇提取酵母蔗糖酶
(1)取上述第4步中的上清夜10mL，缓慢加入10mL的冰冻乙醇(终浓度为50%)，并轻轻搅拌5min， 此过程在冰浴中进行。然后转入离心管中，3000r/min离心5min，离心后取沉淀，倒置于滤纸 上，尽可能地弃去乙醇残液。
(2)将沉淀用15mL的0.01mol/L的PBS(PH6.0)搅拌溶解30min，溶液为混浊液，再离心，10000r/min 离心5min，离心后取上清夜，测酶活C。

(四)蔗糖酶活性测定
酵母蔗糖酶酶促反映体系
试剂    对照A    粗提A1    粗提A2    对照B    热提B1    热提B2    对照C    醇提C1    醇提C2
0.5mol/L蔗糖(mL)    0.3    0.3    0.3    0.3    0.3    0.3    0.3    0.3    0.3
2mol/L NaOH(mL)    0.1    0    0    0.1    0    0    0.1    0    0
40℃恒温水浴准确保温10min
酶液(mL)    0.1    0.1    0.1    0.1    0.1    0.1    0.1    0.1    0.1
40℃恒温水浴准确保温10min
2mol/L NaOH(mL)    0    0.1    0.1    0    0.1    0.1    0    0.1    0.1
DNS(mL)    0.5    0.5    0.5    0.5    0.5    0.5    0.5    0.5    0.5
蒸馏水(mL)    5    5    5    5    5    5    5    5    5
摇匀
OD540nm    0    0.330    0.357    0    0.339    0.373    0    0.003    0.004
酶活(U)    0    33.0    35.7    0    33.9    37.3    0    0.3    0.4

注意：对照管的颜色不能太深，如果太深，需要重新配制蔗糖溶液。

七、实验结果分析：
从实验结果可以看出，粗提和热提（在没有杀死酶的条件下），在同一反应条件下，酶的活性没有发生明显的变化（热提所得到的酶因为去除了其它的部分蛋白质，得到的酶相对纯度较高），证明了酶催化作用的高效性。
而醇提的酶，活性接近于0，原因是酵母蔗糖酶是蛋白质，在醇史其变性，从而失去了酶的活性，同时也验证了酵母蔗糖酶是蛋白质。

八、讨论：
   验证酶活性的实验，注意单因素原则的使用。