植酸酶的毕业论文

jiabenwang · 发表于 2008-5-29 16:25:43

华东理工大学硕士学位论文第1页
基因工程菌毕赤酵母表达重组植酸酶条件优化与代谢流分析
摘要
植酸酶可作为一种新型饲料添加剂，是一种能水解植酸及其盐类的磷酸酶类，能将植
酸磷(六磷酸肌醇)降解为肌醇和无机磷酸。本文对基因工程菌毕赤酵母表达重组植酸酶
的发酵条件在摇瓶中进行优化，实验中发现植酸酶表达的最适诱导时间为60h，最适PH
为4.6,最适甲醇浓度为8g/L，最适磷酸盐和硫酸钱初浓度分别为13.6留L和50叭。然后
在摇瓶实验的基础上，对毕赤酵母表达植酸酶的发酵过程进行了放大研究，在5L和50L
发酵罐上分别得到最大植酸酶酶活为80000OU和86000OU。实验还研究了毕赤酵母从生长
向表达的过渡阶段的关键酶活性发现，在甲醇诱导的开始阶段代谢流存在一个从糖酵解途
径和三赦酸循环向甲醛途径和磷酸戊糖途径过渡的重新分配过程。并根据酶活结果与发酵
中的参数，对甲醇在毕赤酵母中的代谢流分布进行分析，发现在诱导过程，由于菌体合成
大量氨基酸，需要大量的NADPH,所以磷酸戊糖途径的代谢通量增加，另外，此时由于
甲醇浓度的升高，使得通往甲醛途径的通量增加，即实验结果显示甲醛途径的主要生理作
用可能是解毒作用。
关键词:毕赤酵母，发酵优化，酶活研究，代谢流分析

1.1 植酸酶的作用
植酸酶是一种能水解植酸及其盐类的磷酸酶类，能将植酸磷(六磷酸肌醇)降解为肌
醇和无机磷酸。此酶分为两类:3一植酸酶(EC.3 .1 .3 .8 )和6一植酸酶(EC.3 .1 .2 .6)
植酸酶广泛存在于植物、动物和微生物中，如玉米、小麦等高等植物，枯草芽抱杆菌、假
单泡杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌等原核微生物及酵母、根霉、曲霉等真核微生物，但单胃
动物缺乏内源性植酸酶，因而对饲料口粮中植酸磷的利用率很低，必须添加无机磷(如磷
酸氢钙)才能满足动物正常生长发育对磷的需求，这产生了许多问题:首先是磷源浪费;z)
一方面饲料中的磷源不能得到有效利用，另一方面为了满足动物对磷的需求，又必须在饲
料中添加无机磷，提高了饲料成本;其次是形成高磷粪便污染环境[z7饲料中85%左右的
植酸磷会被动物直接排出体外，粪便中大量的植酸磷使水相土壤受到严重污染。另外，植
酸磷还是一种抗营养因子，它在动物胃肠道的消化吸收过程中会与多种金属离子如2n"',
Ca'', Cu", Fez’等以及蛋白质整合成相应的不溶性复合物，降低了动物对这些营养物质的
有效利用,1口
植酸酶可作为一种单胃动物的饲料添加剂，它的饲喂效果已在世界范围内得到了确
证。它可使植物性饲料中磷的利用率提高60%,粪便中磷排泄量减少40 ，同时还可降
低植酸的抗营养作用。植酸酶也主要是通过消除植酸盐抗营养作用来实现它的价值:
1) 提高饲料中磷的利用率:常用饲料谷物玉米、大麦、豆粕、鼓皮中56-70%的磷是
植酸磷，动物无法利用，饲料中必须添加价格很贵的磷盐。植酸酶可以分解植酸磷为无机
磷，在饲料中添加植酸酶后不再需要添加磷酸盐或可减少添加量。一般来讲，日粮中添加
植酸酶，植酸磷的利用率可以提高20-45%;
2) 替代无机磷:无机磷的使用造成了如下两方面的问题，一是为了满足饲料业和养
殖业的需要，消耗了大量昂贵的磷资源，无机磷资源在全世界己处于匾乏状态，一克无机
磷的价格远远超过了一克优质蛋白质的价格。二是日粮中的磷只有很小部分沉积到体内和
畜产品中，因而对环境，特别是集约化饲养时，对地下水和土壤的污染。随着生物技术的
发展，人们发现植酸酶成为解决饲料用磷问题最有吸引力的途径;
3) 解除饲料中抗营养因子，提高饲料中营养物质的利用率:植酸磷会与饲料中的蛋
白质、钙、锰、铁等无机元素和维生素等鳌合，使它们不被利用。植酸酶可分解植酸磷，
解除鳌合，营养物质利用率得以提高。
用植酸酶消除植酸盐抗营养作用的方法有两种:利用植物本身的植酸酶和向植物来
源的饲料中添加微生物产生的外源植酸酶。植物来源的植酸酶不适于在动物饲料中应用，
因为这种植酸酶适宜pH范围为5-5.7，不能在胃中pH较低的情况下起作用(power1993)0

jiabenwang · 发表于 2008-5-29 16:27:03

华东理工大学硕士学位论文第1页
第一章综述
1.1 植酸酶的作用
植酸酶是一种能水解植酸及其盐类的磷酸酶类，能将植酸磷(六磷酸肌醇)降解为肌
醇和无机磷酸。此酶分为两类:3一植酸酶(EC.3 .1 .3 .8 )和6一植酸酶(EC.3 .1 .2 .6)
植酸酶广泛存在于植物、动物和微生物中，如玉米、小麦等高等植物，枯草芽抱杆菌、假
单泡杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌等原核微生物及酵母、根霉、曲霉等真核微生物，但单胃
动物缺乏内源性植酸酶，因而对饲料口粮中植酸磷的利用率很低，必须添加无机磷(如磷
酸氢钙)才能满足动物正常生长发育对磷的需求，这产生了许多问题:首先是磷源浪费;z)
一方面饲料中的磷源不能得到有效利用，另一方面为了满足动物对磷的需求，又必须在饲
料中添加无机磷，提高了饲料成本;其次是形成高磷粪便污染环境[z7饲料中85%左右的
植酸磷会被动物直接排出体外，粪便中大量的植酸磷使水相土壤受到严重污染。另外，植
酸磷还是一种抗营养因子，它在动物胃肠道的消化吸收过程中会与多种金属离子如2n"',
Ca'', Cu", Fez’等以及蛋白质整合成相应的不溶性复合物，降低了动物对这些营养物质的
有效利用,1口
植酸酶可作为一种单胃动物的饲料添加剂，它的饲喂效果已在世界范围内得到了确
证。它可使植物性饲料中磷的利用率提高60%,粪便中磷排泄量减少40 ，同时还可降
低植酸的抗营养作用。植酸酶也主要是通过消除植酸盐抗营养作用来实现它的价值:
1) 提高饲料中磷的利用率:常用饲料谷物玉米、大麦、豆粕、鼓皮中56-70%的磷是
植酸磷，动物无法利用，饲料中必须添加价格很贵的磷盐。植酸酶可以分解植酸磷为无机
磷，在饲料中添加植酸酶后不再需要添加磷酸盐或可减少添加量。一般来讲，日粮中添加
植酸酶，植酸磷的利用率可以提高20-45%;
2) 替代无机磷:无机磷的使用造成了如下两方面的问题，一是为了满足饲料业和养
殖业的需要，消耗了大量昂贵的磷资源，无机磷资源在全世界己处于匾乏状态，一克无机
磷的价格远远超过了一克优质蛋白质的价格。二是日粮中的磷只有很小部分沉积到体内和
畜产品中，因而对环境，特别是集约化饲养时，对地下水和土壤的污染。随着生物技术的
发展，人们发现植酸酶成为解决饲料用磷问题最有吸引力的途径;
3) 解除饲料中抗营养因子，提高饲料中营养物质的利用率:植酸磷会与饲料中的蛋
白质、钙、锰、铁等无机元素和维生素等鳌合，使它们不被利用。植酸酶可分解植酸磷，
解除鳌合，营养物质利用率得以提高。
用植酸酶消除植酸盐抗营养作用的方法有两种:利用植物本身的植酸酶和向植物来
源的饲料中添加微生物产生的外源植酸酶。植物来源的植酸酶不适于在动物饲料中应用，
因为这种植酸酶适宜pH范围为5-5.7，不能在胃中pH较低的情况下起作用(power1993)0
第2 页华东理工大学硕士学位论文
肉鸡饲料中含0.6-1.2%的抗营养因子植酸。导致饲料中的多种养分消化率降低。饲料中
添加合成的氨基酸问题就更突出。植酸在消化道还与消化酶结合使活性降低，成为限制生
长的主要因素。植酸含有大约28%的磷，一旦被植酸酶水解后就释放出来，能全面提高多
种营养成分的消化率;
4) 降低动物粪便中磷的含量，减轻对环境的污染;动物粪便中的粪泄入水源会造成
水的磷富化，植酸酶的应用可以大大缓解污染程度，减少量达25-65%c
5) 提高蛋白质和氨基酸消化率:植酸可以络合蛋白质，抑制消化道蛋白水解酶的活
性。日粮中添加植酸酶就可以分解被植酸络合的蛋白质和氨基酸，并终止植酸对其他消化
酶的抑制作用，从而促进氮的消化和吸收。Batterham(1992)和Mroz等(1994)对猪的实
验表明，植酸酶可以提高蛋白质消化率2-12%a Yi等人〔1996)发现。玉米一豆粕日粮中
添加750单位/Kg植酸酶，可提高火鸡苗对氨基酸的消化率，而且日粮蛋白质水平越低，
提高程度越大。Farrell和Martin (1995)在以米糠为基础的雏鸭日粮中添加植酸酶，也
观测到植酸酶可提高氨基酸消化率的事实:
6) 提高动物的消化机能:早在1977年Rojas和Scott就报道了肉仔鸡棉籽饼日粮
中加植酸酶可明显提高消化机能。悉尼大学的肉仔鸡实验中，在小麦一高粱一米糠一豆粕日
粮中添加植酸酶，日粮表观代谢能提高了9%。主要原因可能是植酸酶消除了植酸对下列
物质的抑制作用

1)蛋白质、脂肪和淀粉

2)消化酶如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和胰
蛋白酶。
可见，日粮中添加微生物植酸酶不仅可以促进磷的吸收，还可以提高钙、锌、蛋白
质和氨基酸的利用率。饲料工业对微生物植酸酶的认识和接受，不仅取决于它的作用效果，
还决定于植酸酶的价格、产品稳定性和易操作性。植酸酶能否取得和添加无机磷一样的经
济效益，决定于植酸酶的额外效应，特别是可促进蛋白质和氨基酸的利用方面。如果在综
合评定时考虑后两个因素，植酸酶的经济效益将更明显.综上所述，使用植酸酶促进营养
物质的利用，降低磷排出，减少环境污染的潜力是巨大的。因此在饲料中添加植酸酶对提
高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。但是，植酸酶到目前为止并没
有在饲料中得到广泛的推广应用，主要原因在于:1，植酸酶在天然材料中的含量太低，
难以大量生产，生产成本昂贵:2，植酸酶的抗逆性，尤其是热稳定性不能完全满足饲料
及饲料加工的要求

}ol随着基因工程技术的发展，为这些问题的解决提供了一条有效的新
途径，植酸酶的基因工程研究已成为世界性的研究热点[al
1.2植酸醉研究的历史与现状
在营养型饲料添加剂中，酶制剂是近年来各国研究人员和企业最为关注的新领域，都
期待着出现安全、环保、高效和经济性能优异的新产品。1999年植酸酶全球销售额为全
部饲料酶制剂的49%.在德国和荷兰，超过90%的猪鸡饲料添加了植酸酶。
开发植酸酶的原因只有植酸。早在1915年Anderson提出天然植酸磷利用率不同于
化学分离纯化产品的一个可能原因是饲料成分中存在水解植酸磷为无机磷的酶— 植酸

jiabenwang · 发表于 2008-5-29 16:27:31

第2 页华东理工大学硕士学位论文
肉鸡饲料中含0.6-1.2%的抗营养因子植酸。导致饲料中的多种养分消化率降低。饲料中
添加合成的氨基酸问题就更突出。植酸在消化道还与消化酶结合使活性降低，成为限制生
长的主要因素。植酸含有大约28%的磷，一旦被植酸酶水解后就释放出来，能全面提高多
种营养成分的消化率;
4) 降低动物粪便中磷的含量，减轻对环境的污染;动物粪便中的粪泄入水源会造成
水的磷富化，植酸酶的应用可以大大缓解污染程度，减少量达25-65%c
5) 提高蛋白质和氨基酸消化率:植酸可以络合蛋白质，抑制消化道蛋白水解酶的活
性。日粮中添加植酸酶就可以分解被植酸络合的蛋白质和氨基酸，并终止植酸对其他消化
酶的抑制作用，从而促进氮的消化和吸收。Batterham(1992)和Mroz等(1994)对猪的实
验表明，植酸酶可以提高蛋白质消化率2-12%a Yi等人〔1996)发现。玉米一豆粕日粮中
添加750单位/Kg植酸酶，可提高火鸡苗对氨基酸的消化率，而且日粮蛋白质水平越低，
提高程度越大。Farrell和Martin (1995)在以米糠为基础的雏鸭日粮中添加植酸酶，也
观测到植酸酶可提高氨基酸消化率的事实:
6) 提高动物的消化机能:早在1977年Rojas和Scott就报道了肉仔鸡棉籽饼日粮
中加植酸酶可明显提高消化机能。悉尼大学的肉仔鸡实验中，在小麦一高粱一米糠一豆粕日
粮中添加植酸酶，日粮表观代谢能提高了9%。主要原因可能是植酸酶消除了植酸对下列
物质的抑制作用

1)蛋白质、脂肪和淀粉

2)消化酶如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和胰
蛋白酶。
可见，日粮中添加微生物植酸酶不仅可以促进磷的吸收，还可以提高钙、锌、蛋白
质和氨基酸的利用率。饲料工业对微生物植酸酶的认识和接受，不仅取决于它的作用效果，
还决定于植酸酶的价格、产品稳定性和易操作性。植酸酶能否取得和添加无机磷一样的经
济效益，决定于植酸酶的额外效应，特别是可促进蛋白质和氨基酸的利用方面。如果在综
合评定时考虑后两个因素，植酸酶的经济效益将更明显.综上所述，使用植酸酶促进营养
物质的利用，降低磷排出，减少环境污染的潜力是巨大的。因此在饲料中添加植酸酶对提
高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。但是，植酸酶到目前为止并没
有在饲料中得到广泛的推广应用，主要原因在于:1，植酸酶在天然材料中的含量太低，
难以大量生产，生产成本昂贵:2，植酸酶的抗逆性，尤其是热稳定性不能完全满足饲料
及饲料加工的要求

}ol随着基因工程技术的发展，为这些问题的解决提供了一条有效的新
途径，植酸酶的基因工程研究已成为世界性的研究热点[al
1.2植酸醉研究的历史与现状
在营养型饲料添加剂中，酶制剂是近年来各国研究人员和企业最为关注的新领域，都
期待着出现安全、环保、高效和经济性能优异的新产品。1999年植酸酶全球销售额为全
部饲料酶制剂的49%.在德国和荷兰，超过90%的猪鸡饲料添加了植酸酶。
开发植酸酶的原因只有植酸。早在1915年Anderson提出天然植酸磷利用率不同于
化学分离纯化产品的一个可能原因是饲料成分中存在水解植酸磷为无机磷的酶— 植酸
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酶，并对植酸酶的来源、理化特性及作用机理进行了研究，从而引起了许多学者的广泛关
注。 McCance(1944)及Mollgaard(1946)报道小麦、黑麦、黑小麦中具有较高的植酸酶活
性。 Courtois(1945)、Courtois(1950)研究表明，植物植酸酶对植酸磷具有专一性。
San dergrin( 1948),M attson(1947)曾阐明，这种酶较窄的pH值范围内具有活性，但从
其作用条件看这种酶在动物消化道中是有活性的。Nelson( 1968)对植酸酶的研究指出植
物植酸酶活性似乎不够稳定，而且提取纯化有一定难度。Neson(1968)首次发现无花果曲
霉能产生植酸酶，体外实验时这种植酸酶能水解豆粕中97%的植酸磷。此后，植酸酶的研
究开始转入微生物领域。Shieh等(1968)对生产植酸酶的微生物进行了大量筛选，结果
表明大量的曲霉菌群能产生胞外植酸酶，而由土壤分离物无花果曲霉NRRL3135能产生最
大的酶活性。YamadaK 等(1968)由土曲霉Aspergillus terreus培养纯化得到植酸酶
制剂，其最佳pH值为4.5,最适温度为700C,N elso。等(1971)首先研究表明，将来自
无花果曲铆勺纯植酸酶制剂添加到鸡的玉米一豆饼日粮中可有效地分解植酸磷。不过由于
当时植酸酶制剂的生产和实际应用与无机磷相比费用高的多，从而未能应用于饲料中。
近年来，随着发酵工业和生物技术的迅速发展以及人们环境保护意识的提高，采用
DNA 重组技术使微生物产生植酸酶活性大幅度提高，大大降低了植酸酶生产成本，从而使
之得到广泛应用。植酸酶现已成为饲料酶制剂研究的一个热点，尤其在一些畜禽饲养密度
大、环境污染严重的国家如美国、加拿大、芬兰、荷兰、法国、瑞士等。许多科学家对这
一课题很感兴趣，欧洲、北美和其他地区对此的兴趣也与日俱增。在自80年代中期，欧
洲就致力于寻找全面解决无机磷污染的方案。而直接的动因是即将在原欧共体成员国实施
的环境保护议会指引(Council Directivegl/676/EEC)。核心内容之一就是限制养殖业
的磷排泄量，荷兰首当其冲。直到80年代后期，荷兰Wagningen大学克隆植酸酶基因出现
突破，才有了商业开发的可能。德国巴斯夫极为重视饲料添加剂领域。30年来，以优质
的产品和对营养学深入的研究及认识处于世界领先的地位。此时巴斯夫和荷兰的
Gist-brocades (DSM的前身)都意识到了植酸酶的潜力，共同开始集中研究进行商品化
开发。率先利用基因转移技术，于1990年首次成功地用Aspergillusniger工业化规模生
产商品植酸酶。同年获得欧洲饲料添加剂管理机构的全面批准认可，陆续在荷兰、德国等
欧洲市场以酶他富(Natuphos)为商品名上市。1994年起在世界各地市场全面供应酶他富。
从这时起，各国以大学、研究所和各类商业研究机构为主投入了大量的人力物力资源，开
始了大量的研究。我国姚斌等(1998)通过基因工程的方法获得了高效表达、生产植酸酶
的基因工程酵母，其植酸酶的表达量较天然的植酸酶产生菌黑曲霉高3000倍以上，有望
实现植酸酶的产业化生产。目前用于工业生产植酸酶的微生物主要是曲霉，如无花果曲霉
(A.f lcuum)和黑曲霉(A.n iger)，无花果曲霉的植酸酶已经得到分离纯化。黑曲霉的桔醉
酶基因已经克隆和高效表达。Pen J等(1993)还将带育黑曲霉植酸酶基因转入烟草种子
中得到转基因种子，可作为一种新型饲料添加剂(植酸酶占成熟种子可溶性蛋白的196),
用以喂仔鸡，生长速度快，其效果和添加真菌植酸酶或无机磷相当。
从cattail Typha latifolia花粉中分离纯化到一种新型植酸酶，
Akira Hara等(1985)
在PH8.。时活性最大，
第4 页华东理工大学硕士学位论文
对植酸具有专一性，能将50%植酸降解，以肌醇三磷酸为终产物，具有产物专一性。
自发现植酸酶作用之后，研究最多的是植物和微生物内植酸酶(见表1.1, 1 .2)。由
表中可见，多种植物、微生物中含有植酸酶，由于酶源不同，酶的活力也不一样，且分子
量有很大差异，如玉米内的植酸酶分子量为76kDa，而无花果曲霉的植酸酶分子量为
85-100kDa:不同来源的酶其最适pH和温度也不相同，植物中植酸酶最适pH较窄，一般
在4.8-6.0之间，而微生物中植酸酶的最适闭范围较宽，一般在2.5-6.0之间，同一菌
株中往往有同功酶存在，且同功酶的最适pH有所差异，如无花果曲霉中就有最适pH为
5.。、4.0, 3。的3种同功酶。金属离子及某些对金属离子有络合作用的物质对植酸酶活
性有一定的影响，一般Ca''和19n2.对酶活性有一定促进作用，Cat'r使酶活提高120%0酶
的抑制因子各不相同，Z丫，Fe",Cd ",ED TA,,Vg'等对不同来源的酶有不同的抑制作用rzao
表 1. 1 植物内植酸醉的研究情况表
Ta bl el .l C ha ra ct er s of p hy ta s e in p la nt
Source Optimal pH and
Te mp
Km and Erfector
characters
WPheat PH5.15 550C
PH5. 2
Mg- '0. 00 2mo 1/ L
Phytate, P-chloromercuribenzoate and F
So Jy
Bu lr u sh
Co r n
Sperat wheat
pH4.8 600C
pH8. 0
pH4.8
PH6. 0
55'C
45'C
0.3 X 1 0'mol/L
0. 15mmo1/L
2.4 X 1 0-'mo1/ L
1.7 X 1 0'mol/L
11 7umo1/L
40 0u m ol/L
在我国，植酸酶研究尚处于初级阶段。90年代以前，我国在这方面的研究基本上没有开
展。直到九五攻关才对此立题研究，但到现在为止，在我国还没有实现产业化。目前，我
国有几家单位正从事植酸酶的研制和开发，四川联合大学生物工程系徐柳等(1995)从泥
炭中筛选出了几株具有植酸酶活性的菌种。山西大学生命科学系褚西宁等(1995)首次分
离到一种产植酸酶的青霉菌— 灰变青霉(Penicillium Ganescens)，此菌产酶效果较
好，对植酸酶进行部分纯化后，理化性质研究表明:该酶最适pH为5.3和3.5，最适温
度为60"C,K m=1.10 X1 0-'mol/L,Ym =2.3m M/h,Mg -',N aF,N aND:和EDTA等对此酶无抑制作
用.而Cu'',Zn '，Mn"',Fe "等则有较强的抑制作用。变灰青霉固态发酵的初步研究表明，在
280C 恒温培养6天后，植酸降解可达90%，无机磷含量由0.13 %增至0.57%，用4%CaCl2.21 1,0
水溶液抽提固体发醉物，植酸酶活性可达3.12 U/g干菌。浙江省农业科学院微生物研究所
和畜牧兽医研究所(1996)用无花果曲霉研制出无花果曲霉“植酸酶SY-03"，去植酸效
果研究表明:"SY-03”处理脱脂米糠、豆粕、菜粕、玉米、小麦鼓，可分别解除这些底物
中49.35%, 46.25%, 36.63%, 47.27%, 41.51%的植酸，同时每克基质可释放出无机磷分
别为2023, 1750, 1600, 1214, 1388 p g.楼洪兴等(1995)将这种酶制剂用于肉仔鸡的
实验证明，虽然活力不够高，但亦能部分代替无机磷。['61,
华东理工大学硕士学位论文第5页
表1.2微生物内植酸醉的情况
Table 1.2 Characters of phytase in microorganism
Source Optimal pHand
Te mp
Km and characters Effection
Aspergillus terreus p [14. 5, 7 0'C pHl .2 -9.0
Aspergillus niger Activity 2,lu/ml
A7c.912
Aspergillus ficuum Activity l.lu/ml
尸泞1016
Aspergi11us ficuum 58℃ activityl0.5u/ml
VRR13135
Km40 u mol/L
Aspergillus几cuum pH5.0 ,4 .0 ,3 .0 26 51,m ol/L 翩85-100kDa
Aspergillus Ficuum PH6.0-6.5.60℃ KmO.5M 1, Ca" ,F e ", Cu ",Z n", Fe''.'-Mn
爪。1/18.7u/mg
Vatton-77 pH 5. 3$ 03 .5 ,600C Kml.IOX10-'mol/L ED TA ,Z n' ', C d" , B a "', C u-',
Fe"', Al"
Penioillum canescensp 30'C士1 activity45.0u/g Mg ", N a P, N a NO ED TA, C. -',
目前国内外的研究多集中在分子构建阅、酶学性质、菌种筛选等方面，即使研究发酵
多数也以黑曲霉为研究对象，相对而言，研究基因工程菌毕赤酵母为表达系统的则很少，
只讨论了几个甚至是单一参数对发酵的影响。为此本实验从酵母发酵的细胞特性调节为中
心注重全面研究细胞代谢多参数相关特性，来提高产量。
1.3表达系统的构建
本课题采用毕赤酵母(Pichia pastoris)作为生物反应器高效表达了来源于的

jiabenwang · 发表于 2008-5-29 16:27:58

华东理工大学硕士学位论文第5页
表1.2微生物内植酸醉的情况
Table 1.2 Characters of phytase in microorganism
Source Optimal pHand
Te mp
Km and characters Effection
Aspergillus terreus p [14. 5, 7 0'C pHl .2 -9.0
Aspergillus niger Activity 2,lu/ml
A7c.912
Aspergillus ficuum Activity l.lu/ml
尸泞1016
Aspergi11us ficuum 58℃ activityl0.5u/ml
VRR13135
Km40 u mol/L
Aspergillus几cuum pH5.0 ,4 .0 ,3 .0 26 51,m ol/L 翩85-100kDa
Aspergillus Ficuum PH6.0-6.5.60℃ KmO.5M 1, Ca" ,F e ", Cu ",Z n", Fe''.'-Mn
爪。1/18.7u/mg
Vatton-77 pH 5. 3$ 03 .5 ,600C Kml.IOX10-'mol/L ED TA ,Z n' ', C d" , B a "', C u-',
Fe"', Al"
Penioillum canescensp 30'C士1 activity45.0u/g Mg ", N a P, N a NO ED TA, C. -',
目前国内外的研究多集中在分子构建阅、酶学性质、菌种筛选等方面，即使研究发酵
多数也以黑曲霉为研究对象，相对而言，研究基因工程菌毕赤酵母为表达系统的则很少，
只讨论了几个甚至是单一参数对发酵的影响。为此本实验从酵母发酵的细胞特性调节为中
心注重全面研究细胞代谢多参数相关特性，来提高产量。
1.3表达系统的构建
本课题采用毕赤酵母(Pichia pastoris)作为生物反应器高效表达了来源于的
第6 页华东理工大学硕士学位论文
Asp ergilluxs sp.98 植酸酶基因p砂I。毕赤酵母是一种非常成功的外源蛋白表达系统，
它具有以下几个特点:
曰具有启动子aoxI(乙醇氧化酶)，可以精确调控外源基因的表达;
2) 毕赤酵母的基因操作与己经定性的酿酒酵母非常相似;
3) 毕赤酵母呼吸生长的强优先性非常适于高密度发酵;
4) 1 99 3年后，毕赤酵母的表达系统对研究机构公开，使基于此理论的研究得到迅
速发展，到目前为止，200多个外源基因在毕赤酵母中得到成功的表达。
5) 外源蛋白分泌的高效率性。为了使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，需要一
信号肤序列〔SignalS equence),最方便的是利用外源蛋白本身的信号序列，但大多数情
况下，甲醇营养型毕赤酵母不能有效地识别这些信号肤以指导分泌，而采用了酿酒酵母a
交配因子(a-matingf actor)前89个氨基酸残基引导或用酸性磷酸酶1(PHO1)中21个
氨基酸残基的信号肤融合到外源蛋白的N端，均能极有效地指导外源蛋白分泌，还有采用
间质金属蛋白酶(NMP)/间质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)信号序列等。据报道用酿酒酵母
的交配因子信号序列可使甲醇营养型毕赤酵母分泌人血清蛋白达10g/L的水平:
6) 外源蛋白基因遗传高稳定性。由于外源目的蛋白载体以线性质粒整合到甲醇营
养型毕赤酵母染色体上，随染色体的复制而复制，因此外源目的基因在世系传代中异常稳
定，不易丢失。甲醇加入毕赤酵母的培养基后，能迅速诱导合成大量的醇氧化酶(AOX ).
而AOX的合成在含甘油培养基中生长的细胞中受到抑制。AOX是甲醇利用途径的第一个酶，
它催化甲醇氧化成甲酸侧。
由于 A OX 与氧的亲和力低，所以毕赤酵母代偿性产生大量的AOX，约占全部可溶性蛋
白质的30%。毕赤酵母含有两个醇氧化酶基因，分别为aoxl, aox2基因，二者的编码序
列相似，有92%同源性，其蛋白质产物则有97%的同源性。aoxl的蛋白质产物在氧化过程
中起主要作用。aoxl的转录水平大大高于aox2，且aoxl在转录水平上受到严格的双重调
控:甲醇诱导AOX合成，一般的碳分解代谢产物抑制AOX产生。在碳饥饿状态下，只有在
甲醉诱导后，才能启动。OXI的信号转录、翻译闭。
典型的毕赤酵母表达载体含有醇氧化酶基因(5'ao xI启动子、3'ao xl终止序列、3'ao xI
序列)，其中含多克隆位点供外源基因插入:以毕赤酵母组氨醇脱氢酶荃因(HIS4)作为
互补性筛选标志;作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质
粒的序列〔引。表达载体中无酵母复制起点，它是靠同源重组整合入酵母染色体DNA中，并
随酵母的生长传代稳定地存在。
将表达载体用不同的酶切(如BglII . N otI 或SalI 、StuI 等)[5」后线性化，使之整
合于酵母基因组中的aoxI或HIS4基因的位置。整合的方式可以是单一交叉插入，亦可双
重交叉替换，一般来说前一种方式更容易发生。当酵母的aoxl基因被替换而丢失后，就
产生T Nut’表型(methanol utilization slow)，此时它们将利用弱的aox2基因启动合
成AOX，故在含甲醇的培养基中生长缓慢。而野生型的酵母在含甲醇的培养基中生长正常，
被称为Hut表型。
华东理工大学硕士学位论文第7页
中国农科院研究所用的植酸酶来源于Aspergillussp.98,并经过筛选，得到的中性
植酸酶具有独特的优良特性，在pH为3-8的范围内均能维持较高的酶活性，其最适pH
为5.5-7.5,等电点为4.6;能耐受800C-90℃的高温，又能在动物较低温度的体内环境
中发挥高效率。该种性质的植酸酶目前国内外还未见报道，有着巨大的应用潜能。在不同
温度和pH下未经筛选的植酸酶对植酸的K二和转化速率参见表1.3.
表 1. 3不同温度、 pH 下植酸酸对植醛的 K m 和转化速率
Ta bl el .3K m and transform speedo fp hytaset op hytatea t differentT emp andp H
Parameter pli and Temp
2. 5/371C 5. 0/370 2. 5/580C 5. 0/58-C
W P M )
Transform speedSec
50 38 46 40
58 8 6 1 13 216
Asp er gil lusf icu，的phyA结构基因全长1506bp，其中+46-+147的102bp的核昔
酸序列是一典型的真菌内含子序列，其上有真菌内含子的特征保守序列

onor序列一
GTATGC. Lariat序列一GCTGAC及Acceptor序列一CAC。它的基因编码467个氨基酸，根
据信号肤序列的结构规则推断，N端的19个氨基酸为信号肤，信号肤的切割位点在+19
位的Gly之后。来源于Aspergi11 us f icu umN 的植酸酶是一种糖基化蛋白，在phyA编码
的氨基酸序列上，发现了10个潜在的N一糖基化位点(Asn-X-Ser, X为任意氛基酸)。从
氨基酸推断出的理论分子量约为51.4k D,搪基化后的表观分子量在85kD左右。氨基酸序
列上存在组氨酸酸性磷酸酶的活性位点保守序列(Active-site sequence)
CQVTFAQVLSRHGARYPTDSKGK，它位于氨基酸序列的+51`+74，可归为组氨酸酸性磷酸酶这一
家族。Aspergillus ficuum NRRL 3135的phyA基因中G+C含量达到68.3%，这是丝状真
菌中高表达蛋白编码序列所具有的特征之一。植酸酶中主要氨基酸见表I.4.
此外中国农科院还对植酸酶结构基因进行了改造，去掉原phyA基因中的内含子和信
号肤编码序列，在不改变所编码氨基酸的情况下定点突变优化了对此基因在酵母中高效表
达起关键作用的Arg密码子，改选后的植酸酶基因与来源于酿酒酵母的a一因子信号肤编
码序列3'端以正确的阅读框架融合，启动子采用诱型高效AOXI启动子(酒精氧化酶I启
动子)，电击转化后将植酸酶基因整合到毕赤酵母基因组中，重组酵母中表达的植酸酶能
分泌到培养基中，与天然植酸酶在酶学性质上没有差异，具有正常的生物学活性，Arg密
码子经优化改造后。其植酸酶表达量比未经优化的高约37倍。重组酵母经高密度发酵后，
植酸酶的表达量达到5*10,u /ml,以上，比原植酸酶产生菌Aspetgillassf，的表达量高了
4000倍以上Is.
本课题所用的植酸酶基因也来自于黑曲霉，经过DNAS huffling技术的改造，用质
粒导入大肠杆菌，筛选需要的目的基因，再用把目的基因整合到含aoxl基因的窜梭质粒
上，导入毕赤酵母，进行同源重组，得到目标重组毕赤酵母〔al。与其它重组毕赤酵母相比，
本课题所用的菌株有以下良好特性:
第8页华东理工大学硕士学位论文
表1.4: 植酸醉中主要氨基酸一览表
Tablel.4 Amino acids in phytase
Amount Amount
4 菊19 78 翁8 盯20
Met阮ArsserThrcvsVaJTvr
45 60 钊29 浦10 2 n 50
AlaAsPGluPheGlx}IisIleLysLeu
1) 通过基因改组(DNAS huffling)等技术构建和筛选耐900C高温、最适pH为3-7且
活性提高10倍以上的新菌株:
2) 构建多拷贝毕赤酵母整合型分泌表达载体:
3) 通过基因改组，在毕赤酵母的复制型质粒上构建突变基因的表达质粒库，筛选获
得可提高毕赤酵母生长速率1倍以上的突变细胞周期蛋白基因，该基因可以缩短发酵时
间、提高发酵效率。
1.4墓因改组技术的应用
本实验所用的植酸酶基因是通过基因改组的方法进行突变经过进一步筛选得到的。基
因改组技术主要通过基因重组和重排来对某一特定酶进行进化，本实验主要采用最早的基
因改组技术对从黑曲霉中得到的植酸酶进行进化。
本实验中采用的DNA改组技术是1994年由Stemmer等(:z1首次提出，指通过对日的基
因酶切成随机片段，然后进行PCR重聚，由于同源重组而产生基因突变的方法。Stemmer
等用0一内酸胺酶系统作为研究对象，采用DNA改组技术筛选得到了一新菌株，其头抱噢
肪(cefotaxime)最低抑制浓度(WIC)比原始菌株提高16,000倍。实验过程如图1. 1
所示。以重组TEN-1 0一内酞胺酶基因的E.coti为原始菌株，通过实验证明其对抗生素头
抱噢厉的最低抑制浓度(WIC)只有0.02 u g /mL。用DNaseI 将TEN-1基因随机切成小片段，
再用类似于PCR方法把这些小片段重新聚合成完整基因，然后把这些完整基因插入载体。
由于片段之间具有同源性，在重聚过程中不同基因的片段之间发生同源重组而产生突变，
点突变率可达0.7%.重复三次，每次重组后都用含有更高头抱唾肠浓度的平板进行筛选。
耐头抱唾脂最高浓度的平板上的菌株作为下一轮PCR重聚模板，三轮筛选后，再用同样的
方法与原始基因(TEN-1)进行两次回交(backcrossing),以消除不必要的突变。每次回
交后，也用含更高浓度的头抱唾肪的平板筛选，最终得到一个耐头抱噬肪浓度为

jiabenwang · 发表于 2008-5-29 16:28:33

第8页华东理工大学硕士学位论文
表1.4: 植酸醉中主要氨基酸一览表
Tablel.4 Amino acids in phytase
Amount Amount
4 菊19 78 翁8 盯20
Met阮ArsserThrcvsVaJTvr
45 60 钊29 浦10 2 n 50
AlaAsPGluPheGlx}IisIleLysLeu
1) 通过基因改组(DNAS huffling)等技术构建和筛选耐900C高温、最适pH为3-7且
活性提高10倍以上的新菌株:
2) 构建多拷贝毕赤酵母整合型分泌表达载体:
3) 通过基因改组，在毕赤酵母的复制型质粒上构建突变基因的表达质粒库，筛选获
得可提高毕赤酵母生长速率1倍以上的突变细胞周期蛋白基因，该基因可以缩短发酵时
间、提高发酵效率。
1.4墓因改组技术的应用
本实验所用的植酸酶基因是通过基因改组的方法进行突变经过进一步筛选得到的。基
因改组技术主要通过基因重组和重排来对某一特定酶进行进化，本实验主要采用最早的基
因改组技术对从黑曲霉中得到的植酸酶进行进化。
本实验中采用的DNA改组技术是1994年由Stemmer等(:z1首次提出，指通过对日的基
因酶切成随机片段，然后进行PCR重聚，由于同源重组而产生基因突变的方法。Stemmer
等用0一内酸胺酶系统作为研究对象，采用DNA改组技术筛选得到了一新菌株，其头抱噢
肪(cefotaxime)最低抑制浓度(WIC)比原始菌株提高16,000倍。实验过程如图1. 1
所示。以重组TEN-1 0一内酞胺酶基因的E.coti为原始菌株，通过实验证明其对抗生素头
抱噢厉的最低抑制浓度(WIC)只有0.02 u g /mL。用DNaseI 将TEN-1基因随机切成小片段，
再用类似于PCR方法把这些小片段重新聚合成完整基因，然后把这些完整基因插入载体。
由于片段之间具有同源性，在重聚过程中不同基因的片段之间发生同源重组而产生突变，
点突变率可达0.7%.重复三次，每次重组后都用含有更高头抱唾肠浓度的平板进行筛选。
耐头抱唾脂最高浓度的平板上的菌株作为下一轮PCR重聚模板，三轮筛选后，再用同样的
方法与原始基因(TEN-1)进行两次回交(backcrossing),以消除不必要的突变。每次回
交后，也用含更高浓度的头抱唾肪的平板筛选，最终得到一个耐头抱噬肪浓度为
华东理工大学硕士学位论文第9页
640 u g/mL的突变株，其MIC是原始菌株的32, 000倍，比报道过的TEM-1基因的最大MIC
高64倍。Stemmer等在DNA改组TEM-1基因的同时采用易错PCR技术(Error-prone PCR)
进行突变筛选，三轮结果只获得最高MIC浓度为0.32 uglmL的菌株，远远低于DNA改组筛
选的菌株，说明DNA改组技术是一高效的体外蛋白进化方法。
PCR扩增DNA酶降解
. .. 口 .吐臼自.口口...臼
)〕洲民[目0O口)戈二心心心心心心0，
---一-~一~卜
喊例困补闪翻月月产洲州鸽剐冲切
、、、、、、、卜汽、、、、、、、、、入、、丫
选取的内酸胺醉
荃因混合物
电泳分离无引物PCR反应
100-300bp片段困月r月汽.争x心翻拭00民a心x
、、、、、、、、、口.自...口..口口
有引物PCR反应克隆入特定载体在cefotazime
平板上筛选
图 1.1 D NAs huffling的反应过程
Fig-1.1 DNA Shuffling Reaction Process
1. 5酵母细胞高密度培养及调控策略
以甲醇诱导强启动子P.x:而启动基因转录这一特性对于利用毕赤酵母生产外源蛋白是
十分重要的。由于重组蛋白对细胞有毒性作用，在大容量、高密度培养过程中，需要将细
胞扩增阶段与表达阶段分开。其它表达系统需极高浓度的抑制物来阻遏表达，诱导前又需
将之除去。对于毕赤酵母的生物量扩增阶段，只需少量的抑制物，通常为甘油，即可满足
细胞生长并有效地抑制外源基因的表达;在表达阶段，只需让细胞耗尽剩余的甘油，再加
入甲醇诱导即可。这样高密度连续培养可以使表达产量提高'9}< Siegel和Brierley等使
用混合法发酵以缩短蛋白表达阶段的时间。这种方法可使有些表达菌株代谢更活跃ail
毕赤酵母表达株可呈两种表型Nut'和Mut',需要通过实验筛选才能从大量的表达株
中确定产量最高的一个。为了使在小量培养基中与大批量发酵的蛋白产量一致，避免繁琐
的重复实验，小量培养基必须
D 有充足的缓冲液，保证最大通气量:
2) 调节 pH使蛋白质降解减到最低程度:
3) 添加适量的蛋白陈等以提供氨基酸和异源蛋白质合成、分泌所需的能量。
此外，温度对毕赤酵母也有显著的影响。甲醇营养型毕赤醉母斜面培养及种子培养
的温度通常为30'C，而在液体发酵培养表达外源蛋白时温度的调节随酵母生长不同阶段

jiabenwang · 发表于 2008-5-29 16:29:00

华东理工大学硕士学位论文第9页
640 u g/mL的突变株，其MIC是原始菌株的32, 000倍，比报道过的TEM-1基因的最大MIC
高64倍。Stemmer等在DNA改组TEM-1基因的同时采用易错PCR技术(Error-prone PCR)
进行突变筛选，三轮结果只获得最高MIC浓度为0.32 uglmL的菌株，远远低于DNA改组筛
选的菌株，说明DNA改组技术是一高效的体外蛋白进化方法。
PCR扩增DNA酶降解
. .. 口 .吐臼自.口口...臼
)〕洲民[目0O口)戈二心心心心心心0，
---一-~一~卜
喊例困补闪翻月月产洲州鸽剐冲切
、、、、、、、卜汽、、、、、、、、、入、、丫
选取的内酸胺醉
荃因混合物
电泳分离无引物PCR反应
100-300bp片段困月r月汽.争x心翻拭00民a心x
、、、、、、、、、口.自...口..口口
有引物PCR反应克隆入特定载体在cefotazime
平板上筛选
图 1.1 D NAs huffling的反应过程
Fig-1.1 DNA Shuffling Reaction Process
1. 5酵母细胞高密度培养及调控策略
以甲醇诱导强启动子P.x:而启动基因转录这一特性对于利用毕赤酵母生产外源蛋白是
十分重要的。由于重组蛋白对细胞有毒性作用，在大容量、高密度培养过程中，需要将细
胞扩增阶段与表达阶段分开。其它表达系统需极高浓度的抑制物来阻遏表达，诱导前又需
将之除去。对于毕赤酵母的生物量扩增阶段，只需少量的抑制物，通常为甘油，即可满足
细胞生长并有效地抑制外源基因的表达;在表达阶段，只需让细胞耗尽剩余的甘油，再加
入甲醇诱导即可。这样高密度连续培养可以使表达产量提高'9}< Siegel和Brierley等使
用混合法发酵以缩短蛋白表达阶段的时间。这种方法可使有些表达菌株代谢更活跃ail
毕赤酵母表达株可呈两种表型Nut'和Mut',需要通过实验筛选才能从大量的表达株
中确定产量最高的一个。为了使在小量培养基中与大批量发酵的蛋白产量一致，避免繁琐
的重复实验，小量培养基必须
D 有充足的缓冲液，保证最大通气量:
2) 调节 pH使蛋白质降解减到最低程度:
3) 添加适量的蛋白陈等以提供氨基酸和异源蛋白质合成、分泌所需的能量。
此外，温度对毕赤酵母也有显著的影响。甲醇营养型毕赤醉母斜面培养及种子培养
的温度通常为30'C，而在液体发酵培养表达外源蛋白时温度的调节随酵母生长不同阶段
第 10页华东理工大学硕士学位论文
应有不同的温度以满足各阶段温度的需要。如果温度过高，细胞生长和表达外源蛋白将受
到抑制，并且色素增加:如果温度过低，由于培养是散热的，因而培养开支要增大，且复
杂的操作要增加:当温度适当时外源蛋白的表达量不仅可以得到提高，并且可以减少
10-30%的色素。这可能是由于热处理蛋白酶没有被激活，或者是色素得到了有效的抑制。
通常甲醇营养型毕赤酵母最适生长pH为4.8-5.2，同时也是一些外源蛋白如乙肝表面抗
原、人血清白蛋白高效表达的范围。Prevatt等认为HSA在此pH范围时P.pa sto ris分泌
到发酵液中HSA表达量为。.71 -0.87 g/1，但是在外源蛋白表达阶段通过调节PH为5.7至
6.4时，rHSA表达量至少可以提高50%。导致这一结果可能是:a.增加了含有启动子和信
号基因表达盒的甲醉营养型毕赤酵母转化子的产量;b.此pH范围对许多含有信号序列和
成熟外源蛋白的结构基因是有促进代谢用处的;c.影响了蛋白酶的活力，因而对外源蛋白
酶解较少，累积外源蛋白量增多。
高密度培养酵母固然可以大大提高培养基上清液中分泌蛋白的含量，但随着重组蛋白
的分泌增多，其它一些细胞内物质如蛋白酶也分泌增多，在培养基中积累，大多数重组蛋
白被降解，严重影响产量.Barr在表达分泌型人血清蛋白时，为了减少蛋白产物的降解，
向培养基中添加蛋白脉或酪蛋白水解物。它们是富含氨基酸的物质，可以作为蛋白酶作用
的底物以保护重组蛋白不被降解[}`0'a Clare等则利用改变培养基PH值以防止蛋白降解。
毕赤酵母可以在pH3饰的范围内生存，因而当调节pH为酸性时，可以有效抑制中性蛋白
酶的活性。Gleeson应用一个pep4基因突变的酵母株作宿主产生类胰岛素生长因子1
(IGF-1). pep4基因编码一蛋白酶，它负责激活其它蛋白酶，因而pep4基因缺失的毕赤
酵母中蛋白酶活性很低，使工GF一工的产量提高约50%(121.
1. 6代谢工程对生物工程领域的作用与意义
代谢工程是生化工程的一个前沿研究领域，自从BaileyE"'1991年在Science上发表
著名文章”Toward a Science of Metabolic Engineering”以来，其发展迅猛，并己形
成研究热潮。
代谢工程是一门研究改造代谢途径、改善微生物性能，以得到更多的产物和原来不能
合成的新物质的一门新兴学科，其理论中心就是将每个反应当作网络的一个环节而不是单
个的反应。代谢工程的一个要点就是对要被修饰或引进的反应的认定，然后应用分子生物
学技术对相应的基因或酶进行放大、抑制或消除、转移和调节，在这种情况下，DNA技术
是一种常用的技术.美国自然科学基金会代谢工程项目负责人Heineken``'给代谢工程定
义如下:“代谢工程是对细胞内代谢途径进行定向的、有目的地改造以便更好地理解和利
用胞内代谢进行化学转化(chemical transformation)、能量转导(energy transduction)
和超分子组装(supermocular assembly).
代谢工程的主要目的就是优化代谢网络，得到所需代谢物的最大收率，其特征是用定
量的方法操纵荃因变化，由分析和合成两部分组成。因为胞内代谢分析比较困难，过去的