微生物脂肪酶的纯化方法（转贴）

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脂肪酶又称甘油三酯水解酶, 是一类特殊的酯键水解酶，它广泛地存在于动物组织、植物种子和微生物体中。
就工业方面而言，大多数工业应用不需要制备纯酶，然而，纯化的程度会影响酶的利用率传统的脂肪酶纯化既繁锁又耗时，且终产量较低。而工业上需要低成本、生产周期短、产量高和适应于大规模生产的纯化方法，因此要用新的纯化方法来增加酶的产量和减少下游处理技术的步骤。脂肪酶具有疏水性界面活性和非水系统活性，因而与其它酶纯化方法不同。近年来，一些新的纯化技术已应用于脂肪酶的纯化，如膜处理、免疫纯化、双水相系统、反胶团系统等，通常这些方法应用在纯化前期，以增加酶的产量。
脂肪酶具有广泛的应用价值，它在有机化学工业、去污剂工业、生物表面活性剂合成工业、油化学工业、农用化学品工业、造纸业、营养业、化妆品工业、制药业等的生产中都有应用，这与脂肪酶合成新复合物技术的迅速发展有关，从而扩大了脂肪酶的应用。本文就微生物脂肪酶的纯化方法及其应用领域进行了阐述。

纯化方法
绝大多数脂肪酶属于胞外酶，其纯化步骤包括将含有酶的培养上清液通过过滤、硫酸铵沉淀或有机溶剂提取等方法对样品进行浓缩。在有些报道中介绍了沉淀法得到的酶产量较高，因此这样的酶制品可应用到一般的去污剂工业中。而对于某些应用，如在制药业中的合成反应，需要进一步的纯化。脂肪酶具有疏水性，大量的活性位点位于其疏水表面。近几年内，疏水层析已经得到广泛的应用。脂肪酶的纯化产品也可以从亲和层析中得到，亲和方法可以用在纯化前期，但由于其材料昂贵，通常在沉淀之后选用离子交换和凝胶过滤4。

沉淀法
通常在前期纯化过程中，粗酶液先用沉淀法进行分离，大约80%的纯化方法中60%用了硫酸铵沉淀，35%用了乙醇、丙酮或酸（一般用盐酸）进行沉淀。脂肪酶活力的大小与所用硫酸铵溶液的浓度有关，在处理大量材料时，硫酸铵沉淀对非蛋白物质的影响比层析要小。与其它方法相比，沉淀法通常可得到87%的酶，而其它方法只得到60~70%的酶。

层析法
一般只用一种层析法不能达到要纯化的水平，选择纯化微生物脂肪酶的层析法取决于制备的粗酶液，即使同一种粗酶液也要用不同的纯化方法，因此要用几种层析法对酶进行纯化。其中最常见的方法是离子交换层析，常见阴离子交换剂DEAE纤维素，阳离子交换剂CM纤维素和强离子交换剂TEAE纤维素，在脂肪酶纯化中，常用Q-Sepharose离子交换层析。纯化过程中，另一种常用的方法是凝胶过滤，此外亲和层析、疏水层析（最常用的疏水吸附剂含有辛基和苯基官能团）和吸附层析（最常用的吸附剂是羟基磷灰石）也可用于微生物脂肪酶的纯化。
若在纯化前期用亲和层析，则成本较高，因此在沉淀之后一般采用低成本的离子交换和凝胶过滤。虽然凝胶过滤对蛋白的承载能力较低，但把它用在纯化前期或后期，可使纯化方法更加完善。

膜处理
膜的错流过滤技术应用于脂肪酶的下游处理过程中，即将失去生物活性的细胞从培养基中分离，从而使含有脂肪酶的上清液得以浓缩。采用具有毛细作用的超滤膜对脂肪酶加以纯化的技术已有广泛应用。Stajer和Bryjak研究了用超滤毛细管对Pseudomonas.fluorescens脂肪酶进行纯化，他们用两种类型的毛细管膜，即聚丙烯腈（PAN）和聚砜（PS）进行实验，结果发现在亲水PAN膜上可以使酶纯化15倍，而在PS膜上仅可纯化3倍，因此PS膜适用于酶的浓缩，而PAN膜适用于酶的分离。

免疫纯化
免疫纯化是一种最有效、选择性最强和亲和力极强的蛋白纯化方法，通过进一步的反应即可将酶纯化1,000~10,000倍。高度专一的抗体可以识别性质非常相似的抗原，这种方法克服了其它方法所无法解决的难题。绝大多数的免疫纯化过程要用到单克隆抗体或者具有亲和纯化能力的多克隆抗体，这种方法的选择要依据单克隆抗体对靶蛋白的利用率以及原料的组成，即原料的类型和纯度。Bandmann等人用Lg—亲和层析对Escherichia.coil产生的修饰性角质脂肪酶异变体进行了纯化。虽然免疫纯化是一种具有高度选择性和非常有效的纯化技术，但它也是一种最贵的亲和方法，尤其在有些纯化过程中还用到了单克隆抗体，因而这项技术在应用方面受到了限制。

双水相系统
双水相系统（ATPS）的发展已有很长的一段时间。Beijeronck(1896)将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合，发现了双水现象。而1956年Albertsson利用此现象成功地分离了叶绿体，在此领域取得了突破性的进展，从而开创了双水相萃取技术（获得了两相均含高溶度水的双水相系统）。这解决了蛋白质变性和沉淀的问题。因此，在微生物脂肪酶的纯化过程中也可采用双水相系统法。
Terstappen等人研究了以去污剂为基质的双水相系统对Pseudomonas. cepacia脂肪酶进行了纯化，并且发现所有的原核脂肪酶都适应于以去污剂为基质的双水相系统。Queiroz等人用PEG/K3PO4双水相系统对Chromobacterium.viscostum脂肪酶进行了纯化，经研究发现，pH、离子强度、PEG分子量和双水相系统中盐的类型将影响双水相系统对酶的分离。因此只要适度的改变分离的条件，即可控制好双水相系统的分离纯化。

反胶团系统
自20世纪70年代末期学术界提出了利于用反胶团液萃取蛋白质技术以来，这一新技术越来越受到重视，其最大的优点是萃取过程中蛋白质由于受到反胶团的保护而变性。反胶团通常是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的纳米尺寸的一种聚集体。在反胶团中，表面活性剂的非极性尾在外与非极性的有机溶剂接触，而极性头则向内聚集形成一个极性核，根据相似相溶原理，该极性核具有溶解极性物质的能力，如水、盐、蛋白质等物质。如果极性核溶解了水后就形成了“水池”，此时的反胶团也可以称为溶胀的反胶团。当蛋白质溶于此“水池”后，由于周围水层和极性头的保护，蛋白质不会与有机溶剂接触，从而不会造成失活。
Vinecete等人用以AOT为基质，苯为有机溶剂的双水相系统对Chromobacterium.viscosum脂肪酶进行了选择性分离和纯化。
pH值会影响表面活性剂的极性头和带电荷的蛋白质之间的静电作用，另外，疏水作用也对蛋白质的迁移起作用，尤其在它们表面有疏水性蛋白质，如脂肪酶。虽然反胶团系统适用于脂肪酶的纯化，但它并没有被研究者很好地利用。

疏水层析
Queiroz等人研究了用层析纯化酶时固定相的组成对分离的影响。他们用一种环氧活化隔离物作为层析配体来纯化Chromobacterium.viscosum脂肪酶，该脂肪酶的滞留量取决于所用的盐和增加的离子强度。
Queiroz等人也研究了用聚乙二醇作为固定相的疏水层析纯化C.viscosum脂肪酶，经研究发现，脂肪酶的滞留物取决于所用的盐、离子强度和pH，与改变Sepharose中聚乙二醇骨架的分子量无关。Diogo等人用聚乙二烯作为固定相的疏水层析对C.viscosum脂肪酶进行纯化，发现在凝胶中脂肪酶滞留物取决于固定相中所用的盐，并且当增加固定相离子强度时，在凝胶中脂肪酶滞留物增加，然而，改变固定相的pH对酶的滞留物影响不大。
Battinelli等人用在十二烷酸作用下形成的交叉联合聚乙烯醇作为疏水层析的固定相，对Candida.rugosa进行纯化，结果表明，通过逐步增加在HEPES-EDTA pH7.6洗脱缓冲液中丙磺酸3-（3-胆酰胺丙基）二甲胺内盐(CHAPS)的浓度，可以洗脱柱中的滞留蛋白。

结语
在蛋白质纯化过程中我们应主要考虑以下三方面问题：最终产品的纯度及处理量，脂肪酶蛋白质来源于何种物质，采用何种设备更合适。这三方面的不同直接导致纯化方法的不同。当然还有一些次要方面也会影响纯化方法的选择，如再生性、经济性,等等。
一般只用一种纯化方法得不到较高纯化的脂肪酶。因此要用几种纯化方法进行纯化。近年来，新技术的发展常常应用于纯化方案的第一步，从而使回收率得以提高，尤其是将新的方法与传统的层析方法结合起来可以使脂肪酶的回收率更高。一些脂肪酶的立体结构已被测得，因此利用结构与功能的关系，使我们能够采用一些新颖的、高效的纯化方法，从而使酶的纯化得以发展，使得分离纯化脂肪酶更加简单、有效且回收率高。
除上面所述应用外，脂肪酶还可用于油脂垃圾和聚氨酯的快速降解。脂肪酶的应用主要是利用它的水解作用、合成作用、转酯作用、风味改良、植物香味改良、品质改良以及对映异构选择性，大多数工业生产的微生物脂肪酶是出自真菌和细菌的酶，这些酶可用于有机合成、去污剂添加剂和食品工业。虽然脂肪酶具有良好的应用前景，但发展很慢，其限制因素包括脂肪酶生产成本相对较高，专一性催化的酶相对较少以及各种应用领域自身的特点，这些都使脂肪酶的应用受到了限制。因此，为了使脂肪酶更广泛地应用于各个领域，就要不断改进脂肪酶的纯化方案，使脂肪酶的生产成本降低，从而缩短生产周期，提高酶的回收率。