木质纤维素稀酸水解糖液乙醇发酵研究进展

细履平沙

木质纤维素稀酸水解糖液乙醇发酵研究进展
田 沈 姚莹秋 蔺增曦   杨秀山*
（首都师范大学 生命科学学院 北京 100037）
摘要：以木质纤维素为原料生产燃料乙醇，首先要对原料进行预处理得到可发酵糖，在稀酸水解木质纤维素得到的糖液中，除含有葡萄糖、木糖等六碳糖和五碳糖外，根据水解温度、酸浓度和时间的不同，还含有不同浓度的发酵抑制剂。因此，在研究木质纤维素稀酸水解糖液的乙醇发酵中，对代谢木糖成乙醇的菌种的研究、对耐/代谢发酵抑制剂微生物的研究、对稀酸水解液的脱毒方法的研究以及对稀酸水解糖液不同发酵方式的乙醇发酵研究等非常重要。本文重点介绍了以上几个方面近几年研究的进展。
关键词：木质纤维素稀酸水解糖液，发酵抑制剂，乙醇发酵
中途分类号：                文献标识码：                文章编号：

DEVELOPMENT OF ETHANOL PRODUCTION FROM LIGNOCELLULOSIC HYDROLYSATES

Abstract: Ethanol can be produced from lignocellulose by first hydrolysing the material to sugars, including hexose, and pentose, and then fermenting the hydrolysate to ethanol. Hydrolysis using dilute-acid has advantages over other methods, however, compounds which inhibit fermentation are generated during this kind of hydrolysis. Therefore, it is important to focus on microorganisms metabolizing xylose and tolerating/decomposing inhibitors, on detoxification methods of hydrolysates with low-cost and facilitated to scale-up, and different fermentation modes in ethanol production from hydrolysate. This review summarized the advance in above aspects.
Key words: Hydrolysates of dilute-acid lignocellulose, fermentation inhibitors, ethanol production

以生物质为原料生产车用燃料乙醇，可大量减少温室气体的排放[1, 2]，近年来欧盟提出到2005年生物质燃料的使用量将占车用燃料消耗量的2%；到2010年将会达到5.75%[3]。美国、巴西、欧盟的农业政策开始向新兴的乙醇工业倾斜，即用玉米、甘蔗和其他木质纤维素等生物质原料商业化生产乙醇。
在以木质纤维素为原料生产乙醇的研究开发领域中，稀酸水解被人为是最容易实现商业化生产的工艺，国内外在该领域进行了大量和深入的研究，我国也已完成了以木屑为原料稀酸水解生产燃料乙醇的示范工程，年产600吨燃料乙醇。但到目前为止，国内外在用稀酸水解木质纤维素生产燃料乙醇方面还存在着一些问题未能解决，研究开发主要集中在两个方面，一是木质纤维素水解得到高浓度的糖和较低浓度发酵抑制剂的水解糖液，二是水解糖液的高效乙醇发酵，包括高效利用葡萄糖和木糖产乙醇，耐/分解发酵抑制剂的微生物菌种。
本文主要对木质纤维素稀酸水解液生产燃料乙醇的下游技术，即稀酸水解液的乙醇发酵进行深入的探讨，包括发酵葡萄糖和木糖成乙醇的菌种问题，水解液对发酵微生物的毒性问题等进行概述。

一、木糖乙醇发酵
1 木糖乙醇发酵途径
*国家高技术研究发展规划（863计划）课题资助项目（No.2002AA514010）
**联系人 Tel:01068902330
收稿日期：         修回日期：
大多数细菌(如 Escherichia coli 和 Bacillus 等)首先在木糖异构酶作用下, 将木糖转化为木酮糖，然后在木酮糖激酶的作用下转变成磷酸木酮糖，继而进入磷酸戊糖途径(PPP)代谢成为乙醇。但因细菌代谢产生较多的代谢副产物，如乳酸等，且其乙醇耐受力较低，从而使细菌的乙醇转化比较困难。
目前已知至少22种酵母能转化D-木糖成乙醇，但是只有六种酵母菌（Brettanomyces naardenensis, Candida shehatae, Candida tenuis, Pachysolen tannophilus, Pichia segobiensis, Pichia stipitis）能产生相当多的乙醇。其中研究较为深入的只有三种酵母，即C.shehatae, P. tannophilus, P. stipitis。酵母木糖代谢途径比葡萄糖代谢途径复杂得多[8],首先是在依赖NADPH 的木糖还原酶(XR) 的作用下还原木糖为木糖醇，随后在依赖NAD+ 的木糖醇脱氢酶(XDH)作用下氧化形成木酮糖,再经木酮糖激酶(Xylulokinase) 磷酸化形成5-磷酸木酮糖,由此进入磷酸戊糖途径（PPP）。PPP 途径的中间产物6-磷酸葡萄糖及3-磷酸甘油醛通过酵解途径形成丙酮酸。丙酮酸或是经丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶为乙醇，或是在好氧条件下,通过TCA
循环及呼吸链彻底氧化成CO2。酵母的木糖发酵在兼性厌氧条件下进行,其总反应式为：3C5H10O5 →5C2H5OH + 5CO2
所以，木糖乙醇发酵乙醇的最高理论产率为0.51，与酿酒酵母葡萄糖乙醇发酵的最高理论产率相同。细菌和酵母菌利用木糖乙醇发酵途径如图1所示。
















2    木糖乙醇发酵菌种
天然发酵木糖生成乙醇的菌株很少, 并且这些菌株对酸水解糖液中抑制剂和高浓度乙醇的耐受能力也较低,某些菌株的乙醇产率和产量不高或副产物较多,因而通过基因工程技术对这些菌株进行改造以提高木糖乙醇发酵能力成为当前研究的热点,其主要目标为：构建和提高菌株的己糖、戊糖同步发酵能力以拓展原料的范围,提高乙醇的产量和产率,减少发酵副产物,提高菌株对乙醇和发酵抑制物的耐受能力,增强对低pH和高温的耐受性能等。目前，该研究领域的宿主菌株主要集中在Escherichia coli 、Zymomonas mobilis 、Saccharomyces cerevisiae 等。
E. coli 利用底物广泛，具有代谢木糖的所有必需酶，但对糖厌氧发酵形成的产物很复杂,有乳酸、乙酸、琥珀酸和甲酸，且由于E. coli 缺乏丙酮酸脱羧酶( Pyruvate decarboxylase , PDC),而且乙醇脱氢酶Ⅱ(Alcohol dehydrogenase Ⅱ, ADH Ⅱ)的水平较低,不能很好地发酵木糖产生乙醇。对E.coli 进行基因改造的主要出发点是使细胞内的碳代谢流向生成乙醇的方向移动，并提高其对酸水解糖液的耐受性。将Z. mobilis 的丙酮酸脱羧酶基因pdc和乙醇脱氢酶基因adhB 转入E. coli使之能高效地利用己糖和戊糖产乙醇[9] ，从而构建出不同的重组菌株,并筛选出一些性能较好的重组菌，如重组大肠杆菌 KO11能发酵玉米纤维水解液，乙醇产率可达理论值的85%-92% 。孙金凤[10]等从Z.mobilis DNA 扩增出乙醇合成途径的关键酶基因pdc、adhB ,分别用tac启动子控制表达,构建了可以在E. coli JM109中表达的重组质粒pKK-PA、pEtac-PA，但乙醇产率很低。我们用分子克隆技术将运动发酵单胞菌乙醇发酵途径中的关键酶基因pdc和adhB与高表达质粒载体连接,构建出了重组质粒载体pGM-PA，将pGM-PA转化至大肠杆菌,得到了重组大肠杆菌E.coli(pGM-PA)，该菌改变了大肠杆菌的糖代谢途径,使乙醇产量有了明显的提高。固定化重组大肠杆菌E. coli(pGM-PA)发酵混合糖的乙醇产率达到理论值的85%,木糖利用率达到80%，混合糖利用率达83%,达到较高水平。
在重组Z. mobilis方面Zhang等做出了突出的工作[11]，实现了在Z. mobilis 中同时表达E. coli的木糖异构酶基因(xylA) 、木酮糖激酶基因(xylB) 、转醛酶基因(tal) 和转酮酶基因(tktA)。将这四个基因分两组(xylA和xylB，tal和tktA) 组成两个操纵子,分别置于Z. mobilis自身的3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子和烯醇酶启动子下,并将这两个操纵子构建成一个质粒。含有这种质粒的Z. mobilis 重组菌株ZM4（pZB5）可以发酵木糖产生乙醇,得率为0.44g/g。为了增强基因的稳定性，Mohagheghi[53]等将代谢木糖、阿拉伯糖的七个必需酶的基因整合进Z.mobilis的染色体上的特异位点——乳酸脱氢酶基因（ldh）中，由此构建了整合重组运动发酵单胞菌AX101，在不加抗生素的情况下发酵混合糖的乙醇产率达到理论值的84%，同时减少了副产物乳酸的形成。
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是工业上生产乙醇的优良菌株，具有易培养、高乙醇耐受度、耐高糖浓度、耐低浓度发酵抑制剂能力及厌氧发酵等优良品质,一直是乙醇发酵的首选目标微生物，但酿酒酵母缺乏木糖转化为木酮糖所需的酶,因而不能利用木糖产乙醇,但能利用木酮糖[13]。构建利用木糖的酿酒酵母代谢工程菌株,有两个策略,一是在酿酒酵母菌中克隆并表达天然利用木糖真菌的两个基因，即木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2；二是在酿酒酵母菌中克隆并表达细菌的木糖异构酶基因xylA（图1），目的均是在酿酒酵母菌中引入转化木糖形成木酮糖的代谢途径,然后进一步代谢木酮糖产生乙醇。世界上已获得的代谢葡萄糖和木糖成乙醇的重组酵母菌,早期的有1400(pLNH32)，含有XYL1, XYL2, XKS1基因（游离质粒），在以90g/l葡萄糖和40g/l木糖为碳源的混合培养基当中发酵，乙醇产率0.46g/g,乙醇生产能力1.15g/l.h，在以50g/l木糖为碳源的混合培养基当中发酵乙醇产率0.3g/g,乙醇生产能力0.33g/l.h [31]。同样含有XYL1, XYL2, XKS1基因（染色体整合）的菌株TMB3001，在以50g/l葡萄糖和50g/l木糖为碳源批式发酵，乙醇产率0.23g/g，生产能力0.12g/l.h [32]；厌氧连续培养，在以10g/l葡萄糖和10g/l木糖为碳源的培养基中，乙醇产率0.29g/g，生产能力0.21g/l.h [33]。以TMB3001为基础构建的工业菌种A,乙醇产率0.42g/g，生产能力0.11g/l.h [32]。此后一大批以TMB3001为基础的重组酵母涌现出来，如TMB3255，是在TMB3001的基础上敲除了ZWF1基因，经过厌氧批式培养，在50g/l木糖为碳源的培养基中乙醇产率0.41g/g，生产能力0.04g/l.h [34]。TMB3399与TMB3001的不同在于，TMB3399是利用两倍体的酿酒酵母含有XYL1, XYL2, XKS1基因的质粒进行整合，而TMB3001则是用单倍体菌株以同样的质粒进行染色体整合。TMB3400,是在TMB3399的基础上经过甲磺酸乙酯的诱变产生的，在限氧条件下，TMB3399和TMB3400的酒精产率分别为0.21g/g和0.25g/g，生产能力分别为0.001g/l.h和0.1g/l.h。FPL-YSX3P为呼吸突变型菌株，在限氧发酵的条件下，以40g/l木糖混合培养基为碳源，乙醇产率0.29g/g，生产能力0.11g/l.h[35]。
我们已经分别从休哈塔假丝酵母菌（Candida shehatae）和树干毕赤酵母（Pichia stipitis）中克隆出了木糖还原酶基因（xyl1）和木糖醇脱氢酶基因（xyl2）,并且分别将其连入GAL1启动子后,构建了重组表达载体pYES2-XYL12，并用乙酸锂转化技术将pYES2-XYL12转入酿酒酵母（S. cerevisiae YS58）中,得到了重组酿酒酵母（S. cerevisiae YS58-12）。并正在把前面克隆的两个基因分别连在强启动子GAL1和ADH1后,提高酒精的产量。为了增加木糖代谢途径遗传稳定性且提高表达量,还将把这两个带着强启动子的基因连同毕赤酵母（P. stipitis）本身的木酮糖激酶（XKS1）插入酵母多拷贝整合载体,转化到酿酒酵母当中,再整合进酿酒酵母染色体的核糖体DNA（rDNA）中,以得到一株能稳定传代且高量表达木糖代谢途径相关酶的重组酿酒酵母。
木糖转化为木酮糖的另一途径是实现细菌木糖异构酶基因XYLA在在酿酒酵母中异源表达,该酶一步完成木糖向木酮糖的转化,并且不需要任何辅助因子,因而被认为是构建利用木糖酿酒酵母代谢工程菌株的便利途径。但在转化的酿酒酵母细胞中没能获得木糖异构酶的活性，可能是由于蛋白质的不正确折叠造成的，并且即使形成了少量的木糖异构酶活性，木糖醇也是一个竞争性抑制因子[14]。鲍晓明[17]等采取多拷贝整合策略，利用整合载体pYM IKP，将来自嗜热细菌Thermustherm ophilus的木糖异构酶基因XYLA和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)自身的木酮糖激酶基因XKS1插入酿酒酵母工业菌株NAN227的染色体中，得到工程菌株NAN-114 ，首次在酿酒酵母工业菌株中建立了木糖异构酶路径的木糖代谢途径。
尽管基因工程重组菌获得了代谢木糖的能力，但是发酵混合糖时，对葡萄糖的利用速率仍比木糖快，表明木糖的转运显然借助了菌体本身所固有的葡萄糖转运系统,而且被高浓度的葡萄糖所抑制。尽管在过去的数十年内,已先后构建出一批重组菌株,它们对木糖或植物纤维原料水解液的厌氧发酵能力也获得了一定程度的改善,但生产性能仍然不能达到工业生产的要求,主要表现在:重组菌株对营养的要求高,木糖发酵仍然需要添加葡萄糖,菌体生长仍然需要限制性供氧等。分析其原因主要是:仅在受体菌株中过量表达或删除与木糖代谢有关的少数几个关键酶基因,造成了细胞的糖代谢流失衡, 因此这些重组菌株也未能投入商业化生产。进一步研究微生物的木糖代谢机理,构建性能更加优良木糖发酵菌株,提高其乙醇的生产性能,进而降低生产成本是植物纤维原料生物转化生产乙醇技术投入商业化生产的当务之急。
将代谢工程与随机诱变相结合也是菌株改良的一种有效手段。Wahlbom[50]等将木糖还原酶、木糖脱氢酶和木酮糖激酶的染色体重组酿酒酵母TMB3399经过化学诱变得到了突变株TBM3400。在限氧条件下，TBM3400的乙醇产率达到了0.25g乙醇/g木糖，且其木糖还原酶和木酮糖激酶的活性都要高于TMB3399。
另外，对代谢木糖产乙醇的菌种进行以木糖为唯一碳源的菌种驯化，可大大提高代谢木糖产乙醇的能力，如陈新芳等以木糖为底物对利用木糖和葡萄糖产乙醇的3株酵母菌进行驯化，经7个批次的驯化，该菌的木糖利用率达到了87.90%（36h）,混合糖（70g/L,木糖：葡萄糖＝2：5）利用率达到93.95%（24h）[25]。

二、木质纤维素稀酸水解糖液乙醇发酵
1 糠醛、羟甲基糠醛、乙酸等抑制剂对乙醇发酵的影响
在木质纤维素水解过程中会形成多种发酵抑制剂，如糠醛、羟甲基糠醛、乙酸、酚类化合物等。乙酸为半纤维素乙酰基团脱乙酰的产物，糠醛和羟甲基糠醛分别由五碳糖和六碳糖降解产生，芳香类化合物来自于木质素的降解。由于木质纤维素稀酸水解液中发酵抑制剂对微生物乙醇发酵的抑制作用，使发酵水解液中的糖发酵成乙醇受到严重限制，所以获得耐/代谢发酵抑制剂的优良菌种是微生物学家研究的关键问题。
所以减少抑制剂对微生物生长和乙醇发酵的影响非常重要。在稀酸水解过程中，酸浓度和水解时间是产生毒性物质的关键因素。160ºC以下对半纤维素水解几乎没有糖进一步水解产物的形成，高于160ºC，虽然有利于纤维素的水解，但产生了高浓度的糖水解和木质素水解产物，这些产物对乙醇发酵菌种具有高毒性。实验证明，利用木糖的树干毕赤酵母Pichia stipitis在糠醛浓度为0.5, 1.0 and 2.0 g/1时生长分别降低了 25%, 47% and 99%. 当羟甲基糠醛浓度为0.5, 0.75 and 1.5 g/1时，P. stipitis 的生长分别降低了43%, 70% and 100% 。S. cerevsiae 在羟甲基糠醛浓度1 g/1完全抑制了生长和发酵。[20] 当乙酸浓度大于4.0g/L时，重组大肠杆菌KO11乙醇发酵受到影响，当乙酸盐浓度为15.0g/L时，55%木糖在24h不能被利用。加之，各种毒性物质的协同效应还会使毒性进一步加强。
2 木质纤维素水解糖液的脱毒预处理
采用简便、高效、经济的方法去除或减少木质纤维素水解液中的毒性物质，对于提高微生物的乙醇转化效率具有重要意义。用理化和生物法可有效去除或部分去除稀酸水解液中的毒性物质，如活性炭吸附、煮沸、加碱、离子交换，酶处理、里氏木霉(Rrichoder reesei)处理、降解毒性化合物微生物的筛选等。
其中脱毒最好的方法是离子交换法，此法可去除稀酸水解液中大部分的毒性化合物，但该法成本高，不宜在大规模生产中使用。通常所指的0verliming法，是在加Ca(OH)2调节pH到10后,再用H2SO4回调至5.5的脱毒方法，该法脱毒虽然经济有效，但水解液中的糖损失大，操作复杂，不适于在商业化生产中应用[24] [25]。由于活性炭吸附是一较经济和有效的方法，所以对活性炭吸附脱毒做了较多研究，包括pH, 温度, 接触时间, 活性炭浓度对脱毒的影响等 [26]，水解液与活性炭的比例为40：1，30C, 200 rpm震荡1h, 结果证明，稻秆半纤维素水解液用活性炭处理后，木糖转化成木糖醇的效率达到79%。因漆酶能抗酚类化合物对微生物的抑制作用，获得了过量表达漆酶的酿酒酵母，这种产漆酶酿酒酵母能在松木稀酸水解糖液中生长和进行乙醇发酵[27]。近来，有研究者从土壤中分离到1株霉菌Coniochaeta ligniaria C8 (NRRL 30616)，该菌能降解玉米秸秆稀酸水解液中的糠醛和5-羟甲基糠醛[28]，但以水解液中的毒性化合物为唯一碳源和能源生长的菌种，至目前还未见公开报道。我们采用的对稀酸水解液的简单煮沸，去除或减少水解液中易挥发的糠醛和乙酸等毒性化合物，取得了较好的脱毒效果[29]。

3 抑制剂对不同发酵方式的影响
不同的发酵方式对减弱发酵抑制剂的作用及提高乙醇产率具有一定的作用。
在批式发酵中，增大初始接种物浓度对提高乙醇产率和降低细胞对低pH的敏感度具有重要作用。另外，细胞循环发酵，对维持细胞活力及对酸水解液的适应性也很重要。在补料批式发酵中，以缓慢的速度向反应器中添加底物，可使反应器中的各种抑制因子浓度维持在较低水平，从而减小其对发酵的抑制作用。对于连续发酵，由于各种细胞滞留系统的应用，使反应器的最大稀释速率以及乙醇生产速度都得到提高。固定化细胞乙醇发酵也是克服水解液发酵抑制剂毒性的一种方法，尽管固定化技术的大规模应用仍存在着一些问题，如凝胶的稳定性、凝胶膜对物质交换的阻力等。Isabella De Bari[27]等用海藻酸钠共固定化酿酒酵母和树干毕赤酵母细胞，在实验室规模的FBR反应器中进行混合糖连续发酵试验，乙醇产率达到0.4g乙醇/g糖。Mahesh[28]等研究了固定化重组运动发酵单胞菌ZM4（pZB5）的玉米秸杆水解液的批式和连续乙醇发酵特性，其中批式固定化细胞混合糖发酵24h的乙醇浓度为44.3g/L，乙醇产率为0.46g/g糖。连续发酵木糖的最大转化率为91.5%。
4 耐/代谢发酵抑制剂的微生物
通过驯化提高菌种对水解糖液毒性化合物的耐受性是一种不用额外脱毒的常规有效低成本方法[30]。利用基因工程手段提高微生物对抑制剂的耐受性是解决稀酸水解糖液中抑制剂问题的一种方法。Nilsson[21]等研究发现酿酒酵母（S. cerevisiae TMB3000）具有良好的水解液毒性的耐受性，在批式发酵中，该菌还原糠醛的能力比酿酒酵母（S. cerevisiae CBS8066）高三倍，同时还表现出了还原羟甲基糠醛的能力。Sonderegger[22]等比较研究了不同重组、突变酿酒酵母菌株发酵木质纤维素水解液产乙醇的特性，发现酿酒酵母TMB3400具有强的木糖代谢能力，工业菌株F12具有好的水解糖液毒性耐受力。Larsson[36]等发现酿酒酵母（Saccaromyces cerevisiae Pad 1p）在含有芳香族羧酸的稀酸水解液中，过量表达苯丙烯酸脱羧酶（Phenylacrylic acid decarboxylase），转化阿魏酸（ferulic acid）、桂酸（cinnamic acid）等芳香族羧酸为相应的乙烯衍生物，并且乙醇产率和生长速度都得到提高。
菌种驯化是提高菌种对木质纤维素水解液中抑制剂的耐受性、乙醇发酵能力、耐乙醇能力是一种安全、有效手段。Jeffrey[37]等用未驯化的酿酒酵母Y-1528和驯化的酿酒酵母Tembec T1对硬木和软木的稀酸水解液进行细胞循环批式发酵。Nigam[25]用不同浓度的水解液对毕赤酵母进行了连续的驯化，结果表明经过驯化的毕赤酵母的乙醇发酵能力大大提高，最大乙醇产率是0.41g g-1，乙醇产生速率为0.44g L-1h-1。

三、展望
以木质纤维素为原料经济有效地生产燃料乙醇，还需要从提高原料的水解效率、降低水解糖液的毒性、高效代谢木糖和葡萄糖成乙醇及耐/代谢发酵抑制剂的菌种等。在木质纤维素稀酸水解糖液乙醇发酵研究中，虽然已在菌株筛选、菌种的改良、发酵方法等手段使酒精产量得到提高，但木质纤维素原料的水解糖液和发酵木糖产酒精的工业化仍存在许多挑战性问题。最根本的问题还是要在降低乙醇生产成本上进行广泛深入的研究，这就需要对木质纤维素高效水解开始的乙醇发酵的各环节进行更深入的研究，探索最佳途径和生产工艺，取得最好效果。随着研究的深入,木质纤维素稀酸水解糖液生产乙醇会具有广阔的应用前景。

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