请教一些酶酶活的检测方法

罗宾007

糖酵解途径中关键酶酶活的检测方法.磷酸果糖激酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、丙酮酸激酶。另外就是乳酸脱氢酶和丙酮酸脱羧酶以及丙酮酸脱氢酶酶活的检测方法。

文献中我查到一些，但很不清楚，或者是引用了很“古老”的文献，无法找到详细可操作的方法。望有经验的朋友不吝赐教，谢谢！

xieshuhuai

这个我也想知道，我查了相关文献，很少有具体介绍的，哪位高手能不能发点资料学习学习下啊

yxp1717

饲用植酸酶活性的测定
分光光度法
1 范围
本标准规定了以分光光度法测定饲用植酸酶活性的方法。
本标准适用于作饲料添加剂用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。样品最低检出量为90U/kg。
2  引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB/T 6682-1992   分析实验室用水规格和试验方法（net ISO 3696：1987）
3  植酸酶活性单位的定义
样品在底物浓度为2.5 mmol/L、温度37℃、pH值5.0的条件下，每分钟从植酸钠中释放1mol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
4  方法原理
植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的(NH4)3PO4NH4VO3 •16MoO3复合物，在波长415nm下进行比色测定。
5  试剂和溶液
    本标准中所用试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T 6682中规定的三级水。
清洗试验用容器不要用含磷清洗剂。
5.1  0.25mol/L乙酸缓冲液(1)：
A液：0.25mol/L乙酸钠
称取34.02g三水乙酸钠于1000ml容量瓶中，加入900ml水溶解，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放2个月有效。
B液：0.25mol/L乙酸
量取14.75 ml乙酸于1000ml容量瓶中，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放2个月有效。
将B液缓慢加入A液中，同时进行搅拌，直到pH至5.00.01，即为0.25 mol/L乙酸缓冲液（1）
5.2  0.25mol/L乙酸缓冲液(2)：
取上述配制的0.25mol/L乙酸缓冲液(1)900 ml于1000 ml容量瓶中，然后加入0.5g Triton X-100，0.5g 牛血清白蛋白（BSA），溶解后再用0.25mol/L乙酸缓冲液(1)定容至1000 ml
5.3  3.75 mmol/L植酸钠（型号8810）溶液
    称取0.2476g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于100ml容量瓶中，先用70 ml A液（0.25mol/L乙酸钠）溶解,并用上述配制的B液（0.25mol/L乙酸）调pH值到5.0, 最后用0.25mol/L乙酸缓冲液(1)定容至100ml。现用现配(实际反应液中的最终浓度为2.50mmol/L)。
5.4  硝酸溶液：1＋2水溶液。
5.5  100g/L钼酸铵溶液： 称取10g钼酸铵[(NH4)6Mo7O24•4H2O]于100ml容量瓶中，加入1.0ml氨水(25%)用水溶解定容至刻度。
5.6  2.35g/L钒酸铵溶液：称取0.235g钒酸铵(NH4VO3)于100ml棕色容量瓶中，加入2ml硝酸溶液(5.4)，用水溶解定容至刻度。避光条件下保存一周有效。
5.7 颜色终止液：移取2份硝酸溶液(5.4)，1份钼酸铵溶液(5.5)，1份钒酸铵溶液(5.6)混合后使用，现用现配。
5.8  植酸酶标准品(标明准确活性单位和类型)
5.9  磷酸二氢钾(KH2PO4)：基准物
6  仪器和设备
6.1  实验室常用仪器设备。
6.2  恒温水浴：37±0.1℃。
6.3  分光光度计；有10mm比色皿，可在415nm下测定吸光度。
6.4  磁力搅拌器。
6.5  涡流式混合器。
6.6  酸度计：精确至小数点后2位
6.7  离心机：转速为4000r/min以上。
7  试样制备
取有代表性样品，用四分法将试样缩分至200g，植酸酶产品不需粉碎，配合饲料和添加剂预混合饲料需粉碎通过0.45mm标准筛，装入密封容器，防止试样成分变化。
8  测定步骤
8.1  绝对法：
8.1.1  标准曲线
准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾(5.9)于100ml容量瓶中，用0.25mol/L乙酸缓冲液(5.2)溶解，并定容至100ml，浓度为50.0mmol/L。按下面表1的比例稀释成不同浓度，与试样一起反应测定，以吸光值为横坐标，反应体系中无机磷的量(mol)为纵坐标，列出直线回归方程(y=ax+b)。
      表1
标准序号    稀释量，ml    浓度， mol /ml    反应体系中无机磷的量, mol
1    0.51    25    5
2    0.52    12.5    2.5
3    0.54    6.25    1.25
4    0.58    3.125    0.625
5    0.516    1.5625    0.3125
8.1.2试样溶液的制备：
按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.0001g，置于100ml容量瓶中，加入约70ml乙酸缓冲液(5.2)*，一个磁力棒，在磁力搅拌器(6.4)上高速搅拌30min，用乙酸缓冲液(5.2)*定容至刻度(减去磁力棒的体积)。摇匀，在离心机(6.7)上以4000r/min乙离心10min。分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液(5.2)稀释，使样液浓度保持在0.4U/ml左右，待反应。
建议在测定样品时附加一个已知活性的植酸酶参考样，便于检验整个操作过程是否有偏差。
* 以玉米芯、麸皮等为载体时可提高缓冲液5.2中Triton X-100及BSA的浓度至0.5%
8.1.3  反应
    取10ml试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物(5.3)开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，37℃水解30min。
反应步骤及试剂、溶液用量见表2。

表2
反应顺序    样品、标准    样品空白(标准空白)
1.  加乙酸缓冲液(5.1)    1.8ml    1.8ml(2.0ml)
2.  加入待反应液    0.2ml           0.2ml
3.  混合    √    √
4.  37℃预热5min    √    √
5.  依次加入底物(5.3)    4ml          4ml(第二步)
6.  混合    √    √
7.  37℃水解30min    √    √
8.  依次加入终止液(5.7)    4ml          4ml(第一步)
9.  混合    √    √
    总体积    10ml          10ml
8.1.4  样品测定
反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机(6.7)以上4000rpm离心10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计(6.3)415nm波长处测定样品空白(A0)和样品溶液(A)的吸光值，A-A0为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。

9  结果计算和表示
9.1  计算公式
试样中植酸酶的活性，用每克(或mL)试样中的活性单位“U”表示，计算公式如下。

植酸酶活性(U/g)=    c    ×F    ………………………………………………(1)
    M×30×0.2        
式中：
c──根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的y值；
F──试样溶液反应前的总稀释倍数；
0.    2──0.2ml酶稀释液;
M──样品质量
30──反应时间。

yxp1717

发错了，呵呵

yxp1717

发错了

blueicedu

做过磷酸果糖激酶的测定，具体方法简述如下：
1  无细胞粗提液的制备
取一定量发酵液冷冻离心（4℃，8000rpm，10min），用生理盐水清洗2次后，放置在－20℃冰箱备用。
将处理好的菌体悬浮于PED缓冲液（75mM KH2PO4, 2mM DTT，1mM EDTA，pH 7.0）中，冰浴中用超声波破碎（工作功率：400W；工作时间：3S；间歇时间：6S；工作次数：50次），冷冻离心（4℃，10000rpm,30min），上清液即为无细胞粗提液。
将酶无细胞粗提液稀释到一定浓度立即进行酶活检测，蛋白质含量用考马斯亮蓝染色法测定，以牛血清蛋白作为参照标准。


2 磷酸果糖激酶（PFK）酶活测定
该方法是基于磷酸果糖激酶所导致的6-磷酸果糖的磷酸化和后续通过醛缩酶、磷酸丙糖异构酶以及磷酸甘油醛脱氢酶的偶联催化所导致的NADH的增加引起的OD340变化而测定的。
6-磷酸果糖＋ATP         1,6-二磷酸果糖＋ADP

1,6-二磷酸果糖                        磷酸二羟丙酮＋3-磷酸甘油醛

磷酸二羟丙酮                 3-磷酸甘油醛

3-磷酸甘油醛＋NAD＋＋H3PO4                     1,3-二磷酸甘油酸＋NADH＋H＋

该酶测定的反应体系组成列入表4.2中。反应总体积为2mL。


磷酸果糖激酶测定的反应体系

Tris-HCl   (pH 7.6)    50mM
MgCl2•6H2O    5mM
Mercaptoethanol    5mM
NADH    0.15mM
Fructose-6-phosphate    1mM
Fructose-1,6-biphosphate aldolase    0.2U
Triose phosphate isomerase    3U
Glycerol-3-phosphate dehydrogenase    3U
ATP    1mM
Cell-free extract    500uL


加入无细胞粗提液启动反应。
酶活单位的定义：在33℃，pH为7.6的条件下，每分钟导致生成1μmol的NADH所需要的酶量。

比活力的计算公式为：
比活（U/mg）＝稀释倍数×(ΔOD340/min)×Vt/(e×Vs×d×C)   
ΔOD340——吸光度变化率
Vt——反应体系总体积（mL）
Vs——酶液体积（mL）
e——摩尔吸光系数6.22×106, (mL•mol-1•cm-1)
d——比色杯光径（cm）
C——蛋白浓度（mg/mL）

yufeng

向诺维信、杰能科、丹尼斯克、德国AB、日本天野等要样品，在要他们的检测方法，在找专业高手翻译，这样比较好些。国内的东西可以说，不太好用。

haylig

我也是遇到同样的问题，现在需要己糖激酶，丙酮酸激酶，KDPG醛缩酶，磷酸戊糖解酮酶和磷酸己糖解酮酶的活性检测方法，有哪位做过其中的活性检测，能指点一下吗，还有就是代谢网络途径的构建除了参考相同属或者有同一产物的菌之外，能否通过别的方法构建比较精确的途径网络，我在着手于代谢流分析，首先要看构建代谢网络图，但是很多文章都是proposed，并没有所研究菌株的的试验确定的途径，我自己的感觉是途径构建的不好，代谢流的分析结果的精确性就下降了，对以后试验的开展或许都会产生误导，请有相关经验的来一起交流，虽然我是新手，但是我对微生物很感兴趣。

haylig

请问磷酸果糖激酶测定的反应体系中各物质的添加体积是多少，就是它们以什么比例混合然后达到终体积？

Tris-HCl   (pH 7.6)    50mM
MgCl2•6H2O    5mM
Mercaptoethanol    5mM
NADH    0.15mM
Fructose-6-phosphate    1mM
Fructose-1,6-biphosphate aldolase    0.2U
Triose phosphate isomerase    3U
Glycerol-3-phosphate dehydrogenase    3U
ATP    1mM
Cell-free extract    500uL

文科

大家好，我是从事生物发酵法生产丙酮酸的，请问谁能告诉我硫酸胺在发酵过程中的影响和作用