固体发酵

荆棘鸟

呵呵 原来是研究生啊.失敬失敬啊 我还一直以为你是应聘到一个专门做发酵的公司呢.其实我也算不是什么前辈,说不定比你还小呢说来惭愧我只是读的专科出来的去年才毕业的  你读研究生二年级 那想必和我应该差不多 来现在的公司工作了一年,很多东西也只是处于一个摸索阶段.技术部就只有我一个人,也就是说就 能进行技术交流的人一个都没有 完全靠自学边工作边摸索  所以很多时候感觉很多东西都要靠自己,也没有个人可以指导一下,觉得很辛苦,你说你还是学生,那么我还是挺羡慕你的,有问题了可以随时请教老师啊.我都想找人请教都找不到人啊,呵呵.

另外你提到了芽孢菌计数问题,不知道以前你做过食品或者饲料 的细菌总数的测定呢 ,方法和它很类似,但是有一个处理过程,就是样品要经过一个80摄氏度十分钟的处理,目的就是去除除芽孢菌外的杂菌,另外,平板48小时后计数时候要注意挑选可以菌落 制片 革兰氏染色后镜检  不是芽孢菌的 不能计数其中如果有不清楚的 可以再问我 如果有需要我可以专门写一下芽孢菌的检验程序

至于你说到何时生长芽孢的问题,我没有去做生长曲线,不过我觉得从生长曲线上似乎不能推测出何时产芽孢,但是你要想知道何时产芽孢也很容易啊 只要在不同的时期抽检样品,革兰氏染色然后在镜检,染色后的标本芽孢很容易看清楚的  其实我觉得关键不是何时产芽孢 关键在于何时出芽孢率达到80-85%,就可以停止发酵了.

你说的10小时就到对数期了 ,我觉得好快呀 ,不知道是不是因为试验和具体的工业生产还是有区别的原因吧 固体发酵相对于液体发酵来说应该要慢很多的,有时间我也抽我们的样品做一下生长曲线 这点还是很有必要的 我们一般发酵时间 远不止20小时

说到 菌种的筛选问题 我就是个外行了 ,不知道怎么筛选  以什么来判断 就不是很了解了 不知道你们是怎么做到 可否说来听听

huangling

我觉得你懂的挺多的，呵呵，经验比我丰富多了，讲什么都讲的有根有据的。还有就是大家都说专科生的动手能力挺强的，现在跟你交流过后，我也有这种感觉。呵呵，还有你要什么有什么问题，我帮你问我们师兄呀，呵呵，大家互相进步。其实我们老师也不管我们的，就我们自己做，有什么问题了就看资料。
    说的菌种的筛选，我们一般是先取样，从土壤中取地表以下5-20cm的土样。然后进行富集，再通过筛选平板进行筛选。因为我们要的是芽胞杆菌，所以我们在筛选的时候都加过热的，利用芽胞的耐性。当然有的资料写上在平板筛选之前还会进行驯化。其实也相当有一种富集。只不用的是液体培养基而已。筛选的时候一般根据菌种的一些生理生化特征而挑取我们所需要的。例如，抑菌的就根据其抑菌圈的大小来选择。
     呵呵，是不是在固体发酵里要慢一些？我测的生长曲线是在液体培养基里面测的。

荆棘鸟

呵呵  我说呢 怎么这么快 原来真的是液体发酵的  其实一般液体发酵18小时就可以停止了
固体发酵一般是38-40小时 左右停止  其实我的知识也很有限 除了学校的时候的一些基本知识外 其它的都是在工作的一年中自己慢慢体会 还有看相关的书籍掌握的,还有也很感谢细履平沙 他也给了我一些帮助,帮我找了几遍关于枯草芽孢杆菌的文献 看了后也大受启发.目前对于固体发酵知识只是掌握了一小部分,还有很多在试验中,只有我一个人 ,所以干什么都很慢的.最主要的是没有人交流,让我很压抑.其实什么都靠自己,真的很辛苦.

你说的筛选的方法 我好像在一本书上看到过,不过没有亲自做过,也没有看到人做过,再加上你现在所说的也终究是只能了解一个大概机理.不过目前我的重点不在此,以后再看这个问题了.当前的重点是多研究固体发酵的优化条件,包括原料的选择,以及发酵条件各种参数的控制上 年底正好车间改造到时候 就以 发酵条件为依托改造

另外 我也确实有一个问题想要请教 ,如果你不知道就麻烦问一下你的师兄. 是这样的 我做芽孢菌检测时候 ,公司目前的状况条件比较差, 恒温水浴锅 都没有 但是要做芽孢菌的一个 80摄氏度10分钟处理过程 我用的烘干箱代替水浴锅做的  我感觉 可能会对结果有影响 没有 水浴锅标准  在这里我想 核实一下我的想法是不是对的.

好的 以后有问题大家多交流 就像你说的互相进步
.也可以直接通过 邮箱交流  yinhuaquan123201@163.com
另外 我想问一下 你们学的是什么专业 啊

荆棘鸟

以后出来工作了 研究生就比我们专科生工资待遇 要好很多了 呵
我想我们公司就是因为研究生贵所以就请了我这么个便宜又好用的 专科生吧 呵呵 开个玩笑

huangling

你说用烘箱代替水浴锅，我们这边没人做过。我们在筛选的时候都是用水浴锅的。这两天周末，我师兄没来实验室，等他来了我再问他把。不过我觉得烘箱代替水浴锅的话，不同之处就是水分吧。再说芽胞是耐热，抗逆性强。如果能把二者做个比较，就知道对芽胞的影响大不大了。呵呵，我倒是可以做做这个实验。
     呵呵，我学的是微生物专业，现在在做固体发酵的实验。其实我本人是很想做液体发酵的，因为觉得将来出去工作的话，做这个用处更大一些。
     哦，对了，我的邮箱是huangling54321@sohu.com 希望从你那能学到更多的实用的知识。

荆棘鸟

呵 好的 我已经把你的邮箱地址收藏了 有空会和你联系的 。
我学的不是微生物专业，是卫生检验，微生物检验只是我们的一门专业课。早知道出来做微生物当初就该把这门课学好点，现在我的同学大部分是做微生物的，有一些是做水产品检验 一些做化妆品 一些做食品 一些在疾控中心
多是做微生物检验 还有兼做理化检验 。如果可以，我也希望自己能够有机会学习和接触液体发酵，因为这个在工业上用的比较多，学好了很容易找工作，固体发酵呢 ，原料丰富价格低廉 ，很多地方也会用到，但是以后的发展方向，我觉得可能是液体发酵和固体发酵相结合。就是前三级菌种的放大培养用液体，最后再把液体菌种接种到固体发酵。可惜现在我也没有机会接触和学习液体发酵技术，只是在这里看看书和资料，还有就是在论坛上看看帖子，总是觉得这样的效果还是不如亲自接触，实践掌握的知识来的踏实，我现在很想找个地方进行一下液体发酵的培训学习，花点钱都无所谓的，老板也同意我去学习，只是现在找不到学习的地方。我觉得没有液体发酵基础，学习那些论坛上他们发的帖子，在理解上还是要差很多，学起来也特别吃力，也没有多少成效，也或者是我没有仔细去研究吧。学好了液体发酵，即使不在现在的公司呆，到外面发展的空间也相对交大一些。

公司要买什么仪器，总是很麻烦，包括我上次提了买一台微波炉熔化培养基，答应了，到现在半年了还没有买，有时候仪器不齐全做起事情来，感觉缩手缩脚的。我是考虑到一个水分的问题，还有一个就是温度的问题，空气温度80度，但放进去的 装好样品的混合液的水的温度是否能达到呢  我决定今天做一个试验，在80度的烘箱中放一盆水，一定实践后 测定水的温度 就行了 。我知道芽孢耐热，我考虑的是，如果温度达不到，那么可能很多杂菌都没有被杀死，计数的时候会被当作芽孢菌记影响结果的真实性。我也觉得用水浴锅标准一点。因为上次我用大烧杯模拟水浴锅做过一次检测，结果比用烘干箱的 差了很远 我想可能是水浴锅灭菌效果到位点。所有就提出了这个疑问。

我学的知识有限，都是在学习，真的很希望和你这样的人多交流。我知道的一定全部告诉你，不懂的，也会提出来，向你请教。

huangling

我一进实验室，也是分到做固体发酵，根本没有机会去做液体发酵。其实，我也很想多掌握一些液体发酵的知识，因为感觉工业上用的多的还是液体发酵。不过现在好象做固体发酵的又多起来了，很有一些学校都做固体发酵的课题了。呵呵，你说将来可能是将固体和液体发酵联合起来，我觉得很有可能，象现在我做就是用液体培养种子液然后接入到培养基中。我也是正想向我们这里的做液体发酵的人请教。只是我的实验室没有做液体发酵的，只能去别人的实验室请教，挺麻烦的。不过这个论坛上有挺多做液体发酵的。要是自己能做一次的话，就能发现问题了，就能向他们请教了。我觉得做发酵的经验很重要，我有很多同学，他们出去都是去做质检，他们都说一旦工作了就发现“书到用时方恨少”，“要不停的给自己充电”。所以你说要出去学液体发酵，我觉得很明智，我还年轻应该多学一写东西的。到时候你学好了，还能指导我呀。呵呵
    我觉得你用大烧杯模拟，那你温度控制好了吗？水浴锅是恒温的，用烧杯做不好控制温度吧，呵呵，你说你用烘箱做实验，看温度能不能上去，到倒可以试试。那你有没有想过用灭菌锅做呀，设定80度，15分钟做一下呀。呵呵，我就那么想一下。
     你说你们公司买仪器很费劲，其实要能买一个大的恒温水浴锅就好了。我问过我同学，他说用烘箱做应该也行吧，温度能上去就好了。
     还有我想问一下，你做发酵的时候有没有搅拌？我觉得我的种子液加进去，固体培养基的均匀性很差，这点你是怎么做的呢？

荆棘鸟

是啊 我们公司马上就要引进液体发酵设备  一级二级三级放大都用到液体发酵  时间短 细菌纯度高
三级菌液再无菌操作接种到灭菌好的固体原料中去，就是四级了。你看这个过程，用到了液体发酵，是种子，所以要有必要的液体发酵知识，再看接种到固体原料了，最终液体发酵还是为了固体发酵做铺垫，最终还是固体发酵出来成品。所以我觉得你现在有机会学习固体发酵技术应该好好抓住，以后很可能用的着的。液体发酵也要找机会学习啊，我们那时候实习的时候就是每个科室呆几周时间，你们是否也可以学了固体 就和液体发酵的同学交换学习啊 这样大家掌握的知识面就更多了。

我上次用大烧杯模拟的时候温度控制的还是比较好的   因为水的比热还是很大的，散热不会那么快  温度控制再79度 到81度 范围没有问题 用可调式电炉 和温度计 以及随时准备的冷水 这个不难办到。烘箱试验 昨天准备做的，结果操作员要用就没有做成，只有等到今天用了，我觉得如果烘箱里水的温度比80度低 可能就存在一个计数的误差 。  如果79度 还可以接受 差太多就不能在用这种方法检测用了 。
至于高压锅就没有必要试了。 水浴锅不需要很大 因为只是做检测的时候的样品处理  最多同时可能会做两个样品  三个的都很少  ，所以只需要能放下2个 250ml 三角瓶大小的 就够用了 只是不知道 多少钱 我看如果钱不多就再申请一次 应该问题不是很大的。

你说到的固体培养基接种液体菌种不均匀的事情，我是这样想的，肯定应该搅拌一下，作为罐头瓶里的模拟试验，你可以用一个灭菌的玻璃棒或者其它东西 ，在无菌室，打开盖子搅拌一下，不知道你觉得怎么样？以前我也做过用烧杯模拟试验就是这样做的。我们的批量生成也是通过一个搅拌完成的。搅拌的均匀性会直接影响发酵效果。
有一点不得不提醒你，罐头瓶里的试验，和车间那么多量的固体发酵会有些地方不同的。你要注意一下。
一个是温度，小样温度好控制，也容易散热。一旦在车间量大的时候，很多固体料堆在一起，温度不会和罐头瓶里的一样的 ，酸碱度可能也不会一样等等。这些希望你试验的时候考虑一下。因为试验毕竟是要转化到实际的生成中去的。

对了 你做试验用的液体发酵 ，是怎么做的，是不是用 装液体培养基的试管或者三角瓶 接种母种后摇床培养的啊？

还有一个非微生物的问题想请教你们  一个样品中有大蒜素、过磷酸钙、沸石粉、过碳酸钠以及一些微生物，如何测定样品中过碳酸钠及大蒜素的 含量 。我再网上找了下方法 没有找到 看你们有没有人知道 。

huangling

不能通过做液相色谱来吧物质分离吗？我们这他们都经常通过做液相来测定的。只要找到标准品，然后看它什么时候出峰，再在这个时间收集就可以得到想要的物质了。

是的，我的种子液就是接入三角瓶里，在摇床上培养10个小时的。

很谢谢你的对我的提醒，固体发酵本来就不好控制它的条件，别人做液体发酵时，都要一级一级的放大。我们现在做的还是很小很小规模，但是光这样我都觉得条件很难控制了，到时候放大了，我都不知道要怎么控制了。你说你刚开始做的时候，也是在烧杯里面做的，那大概也就装个20g左右的料吧，那你放大的时候是一下子就放大到生产的规模吗？还是经过小试，中试，再用于生产呀？大概中试 的时候要多大的规模呢？要多少料呢？

荆棘鸟

以前学分析化学的时候 也知道很多用到了色谱的方法 有些是高效液相色谱 有些用到气相色谱
但我觉得 样品一般多为有机物  大蒜素也是有机物 不知道可不可以 也找不到标准方法  
另外 我们实验室 只是做一般的检测  都是我在做  微生物的 理化的 包括粗蛋白和水分  其它的就没有做了 也没有什么高档的设备   再者 高效液相我也忘的差不多了 只是以前看老师做过
但是 我觉得 过氧化钠的检测应该考虑 使用化学的方法检测  
我考虑过用盐酸滴定的方法  但是 我觉得过磷酸钙又会起到干扰作用 所以放弃了 还没有想到用什么方法


我说到的以前做过小样试验是在选择原材料的时候做过的   不是考虑放大的问题时候做的 ， 我也没有考虑到 中试、大试  。 从我来这个公司之前他们就已经开始固体发酵了，以前的技术员都走了  ，他们只是按照以前的方法做而已。所以，关于从小样到扩大培养我还真说不上有什么经验，抱歉。不过我觉得，这个问题现在操心也没有多少作用，最重要的是实践，到实践的过程中，才会知道会遇到哪些问题，只有遇到具体的问题了，去解决了，才真正有更深的体会。我们做发酵的时候，也是逐级放大的，最后一级是 发酵三吨固体料，不算加的水。而且最重要的是 我们用的不是固体发酵罐 。这点也是唯一的一个和你们说的固体发酵不同的地方，所以我在分析问题的时候的一些经验，可能很多你都用不上，因为我相信你们以后接触的固体发酵应该是很正规的设备，是用固体发酵罐来做的 。比如通空气除菌问题，你需要考虑，但我们用不上。比如温度的问题 。我相信正规的发酵罐对于温度、空气除菌、翻搅控制起来都是很容易的，但是我们做不到。具体是怎么做的，涉及一些商业秘密我也不能告诉你，但有一点，我们的固体发酵设备很简陋。我也没有接触过真正的固体发酵罐，这些也不能不说是一种遗憾。
至于你说到 ，怎么放大试验，我的想法是，比较科学的方法是前三级放大都用液体发酵的方法，最后再接种到固体原料。那么估计，一级、可以用锥形瓶液体摇床培养，如果你最后的发酵量是1吨 ，估计二级用摇床也可以，但是三级放大的时候一定要用到 大的液体发酵罐了 ，你看有没有机会找一个做相关发酵的工厂实行一下啊 ，这样，会更好些的了解怎么放大，注意什么问题。我觉得我们公司每次 做三吨 已经算是一个比较大量的发酵了，估计一般的固体发酵罐 1吨左右吧 。

如果 你想模拟，我建议你的量最少要达到  100公斤左右才能有一定的代表性。试一下吧，逐级放大试一下。做到150公斤看看发酵的怎么样，菌数多少，芽孢率情况，另外，别忘了做芽孢杆菌最好加一定量的硫酸锰和硫酸镁。至于用量你可以参考一下 固体的0.01％、0.05％ 液体发酵的话比例定为固体量的二十分之一 我也不知道合不合适最好亲自实验一下。 我当初做小样的时候 也是固体原料20克左右，要提的是，还有一个重要的问题，那就是放大培养的时候的接种量的问题。一直以来我都觉得我们的菌数不高和我们用的三级菌种 量不够有关。因为我们的设备当初是做2吨左右的 ，后来把产量加到三吨 ，菌种自然就不够了 ，这个问题一直没有机会研究一下。希望你有时间能研究一下。这个是很重要的，如果少了影响发酵，多了浪费，看接种多少最合适。